铜离子调控 CDK1 激活机制：解锁癌细胞增殖奥秘与癌症治疗新靶点

在细胞增殖相关研究中，为探究铜离子在细胞周期调控中的作用机制，东北林业大学等机构的研究人员开展了关于铜离子与细胞周期蛋白依赖性激酶 1（CDK1）激活关系的研究。结果发现铜离子结合对 CDK1 激活及 G2/M 期转换至关重要，这为癌症治疗提供了新靶点与思路。

　　细胞如同精密运转的微型工厂，每个环节都受到严格调控，而细胞周期的精准调控则是维持生命正常运转的关键之一。在这个复杂的过程中，细胞周期蛋白依赖性激酶 1（CDK1）扮演着至关重要的角色，它是启动细胞分裂的核心激酶，其激活对于细胞从 G₂期进入有丝分裂期（G₂/M 期转换）必不可少 。

过往研究表明，铜离子在众多细胞活动中发挥着关键作用，比如作为多种酶的催化辅因子参与抗氧化防御、铁吸收、细胞呼吸和结缔组织成熟等过程。而且，癌细胞相较于正常细胞，对铜离子的需求量更高，细胞内铜离子水平的升高与异常细胞增殖密切相关。然而，铜离子与细胞周期调控之间的联系，尤其是其对 CDK1 激活的影响，却一直是个未解之谜。正是为了揭开这层面纱，东北林业大学等机构的研究人员展开了深入探究，相关成果发表在《Nature Communications》上。

研究人员运用了多种关键技术方法。在蛋白质研究方面，通过蛋白质质谱分析筛选潜在的铜离子结合蛋白；利用免疫印迹（Western blot）和免疫共沉淀（co - IP）技术，检测蛋白质的表达、相互作用以及铜离子的结合情况。对于细胞实验，借助细胞同步化处理，将细胞同步至特定周期阶段，再结合流式细胞术和荧光泛素化细胞周期指示（FUCCI）技术，精准分析细胞周期的变化 。此外，还运用定点突变技术构建突变体，探究特定氨基酸残基在铜离子结合及 CDK1 激活中的作用。

铜离子对细胞周期 G₂/M 期转换至关重要

为了探究铜离子在细胞有丝分裂中的具体作用，研究人员敲低了 HepG2 和 HEK293T 细胞中的铜离子转运蛋白 1（CTR1），并使用胸苷（TdR）将细胞同步至 S 期。结果显示，CTR1 被干扰后，多数细胞滞留在 G₂/M 期。无论是通过流式细胞术分析，还是利用 FUCCI 系统观察，都能发现这一现象。此外，引入 CTR1 铜离子结合位点缺陷突变体，或者使用去金属化试剂、铜离子螯合剂处理细胞，都会导致细胞在 G₂/M 期阻滞，而补充铜离子则能促进细胞通过 G₂/M 期。而且，添加其他金属离子并不能挽救这一阻滞现象，这充分表明铜离子在细胞周期 G₂/M 期转换中起着不可替代的关键作用。

铜离子结合对 CDK1 激活和 G₂/M 期转换不可或缺

为深入了解铜离子调控 G₂/M 期转换的机制，研究人员对同步至 G₂期的 HepG2 细胞进行蛋白质质谱分析，发现 CDK1 是潜在的铜离子结合蛋白。通过多种实验手段，如免疫印迹、体外下拉实验和等温滴定量热法（ITC），证实了 CDK1 具有铜离子结合能力。进一步利用定点突变技术，构建了铜离子结合缺陷的 CDK1 突变体（CDK1^CBM）。实验表明，表达 CDK1^CBM的细胞在 G₂/M 期出现阻滞，且无法通过添加铜离子恢复。同时，铜离子能增强 CDK1 对底物 p53 和 H1.4 的磷酸化水平，而 CDK1^CBM则失去了这种响应能力，这充分说明了铜离子结合对 CDK1 激活和 G₂/M 期转换至关重要。

铜离子在体外可独立于 CCNB1 激活 CDK1，但在细胞内则依赖于 CCNB1

细胞周期蛋白 B1（CCNB1）作为 CDK1 的调节蛋白，对其激酶活性的发挥起着重要作用。体外激酶实验表明，在有或无 CCNB1 存在的情况下，铜离子都能增强 CDK1 对底物的磷酸化作用。即使去除金属离子，添加铜离子后，CDK1 单独存在或与 CCNB1 共同存在时，都能使底物磷酸化水平增加，这说明铜离子在体外可独立于 CCNB1 激活 CDK1 。然而，在细胞实验中，敲低 CCNB1 会显著降低 p53 和 H1.4 的磷酸化水平，且补充铜离子也无法恢复，这表明在细胞环境中，铜离子介导的 CDK1 激活离不开 CCNB1。

CCNB1 在 G₂/M 期作为铜离子激活 CDK1 的介质

研究发现 CCNB1 也是潜在的铜离子结合蛋白，通过实验验证了其铜离子结合能力。构建 CCNB1 铜离子结合缺陷突变体（CCNB1^CBM）后发现，该突变体虽然不影响与 CDK1 的相互作用，但无法恢复因 CCNB1 敲低而降低的 p53 和 H1.4 磷酸化水平，且会导致细胞在 G₂/M 期阻滞，即使添加铜离子也无法挽救。进一步实验表明，CCNB1 能够将铜离子传递给 CDK1，促进其激活，在这个过程中，CCNB1 充当了铜离子激活 CDK1 的介质。

CCNB1 将铜离子从 ATOX1 传递到 CDK1，激活其激酶活性并促进 G₂/M 期转换

铜离子进入细胞后，会由多种铜离子伴侣蛋白传递至靶蛋白。研究人员通过免疫共沉淀、体外下拉实验和双分子荧光互补（BiFC）分析等技术发现，铜离子伴侣蛋白 ATOX1 能与 CCNB1 相互作用，而 CDK1 则不与 ATOX1、CCS 或 COX17 结合。实验表明，ATOX1 可将铜离子传递给 CCNB1，进而传递给 CDK1，激活其激酶活性，促进 G₂/M 期转换。敲低 ATOX1 或表达其铜离子结合缺陷突变体，会显著降低 H1.4 和 p53 的磷酸化水平，使细胞停滞在 G₂/M 期，这充分说明了 ATOX1 介导的铜离子传递在 CDK1 激活和 G₂/M 期转换中的重要性。

研究结论表明，CCNB1 作为铜离子的转运体，促进了铜离子从 ATOX1 向 CDK1 的转移，进而激活 CDK1，推动 G₂/M 期的转换。这一发现揭示了铜离子促进细胞周期进程的全新机制，为理解癌细胞增殖过程中铜离子水平升高的作用提供了关键线索。由于癌细胞对铜离子的需求较高，且高表达的 CCNB1 和 CDK1 与癌症的侵袭性相关，干扰铜离子通过 CTR1 - ATOX1 - CCNB1 - CDK1 途径的传递，有望抑制癌细胞的分裂，为癌症治疗开辟新的方向。未来，针对铜离子结合在 CDK1 激活中的作用机制，仍有许多问题有待深入研究，比如铜离子结合对 CDK1 结构的具体影响，以及细胞内激活 CDK1 的铜离子氧化态等问题，这些研究将进一步完善对细胞周期调控和癌症发生发展机制的认识，为开发更有效的癌症治疗策略奠定坚实基础。