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研究人员针对 BsmI 内切酶开展研究，解析其晶体结构，揭示切割机制，为酶工程设计奠基。
在微观的生命科学世界里，细菌和古菌拥有一套独特的 “防御武器”—— 限制 / 修饰（R/M）系统。其中，限制性内切酶（RE）就像一把把精准的 “分子剪刀”，能够识别并切割特定的 DNA 序列，保护细菌免受噬菌体等外来 DNA 的入侵。在种类繁多的限制性内切酶中，II 型限制性内切酶是研究最为广泛的一类，但它们的结构和作用机制却存在着显著差异。
目前，对于限制性内切酶的研究仍存在许多未解之谜。例如，虽然已经发现了大量的 II 型限制性内切酶，但其在不同结构状态下与 DNA 底物的相互作用细节，以及切割 DNA 的具体分子机制，仍有待深入探究。而且，精准改造限制性内切酶的特异性面临诸多挑战，由于蛋白质与 DNA 碱基间的接触高度冗余，加之对 DNA 切割过程的结构和机制了解有限，使得相关研究进展缓慢。
为了深入探索这些问题，来自法国巴斯德研究所（Institut Pasteur）等机构的研究人员展开了一项关于 BsmI 限制性内切酶的研究。BsmI 是一种来自嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）的嗜热 II 型限制性内切酶，它在单个单体中含有两个不同的活性位点，能够识别非对称的 5’-GAATGC-3’序列，并精确切割 DNA 的两条链。这项研究成果发表在《Communications Biology》杂志上，为我们理解限制性内切酶的作用机制提供了新的视角。
研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：一是通过定点突变技术构建不同的 BsmI 突变体，如 N0.BsmI、Nt*.BsmI 和 Nb.BsmI 等；二是利用 X 射线衍射技术解析 BsmI 及其突变体与 DNA 复合物的晶体结构；三是采用分析超速离心技术确定 BsmI 在溶液中的存在状态；四是运用正常模式分析（NOLB）研究蛋白质构象变化。
研究结果如下：
- 突变体设计与复合物结构：研究人员设计了底部链失活版本 Nt*.BsmI 和完全失活版本 N0.BsmI。通过 X 射线晶体学解析 N0.BsmI 与同源 DNA 复合物的结构，发现 BsmI 在溶液中主要以单体形式存在。
- 结构域特征：BsmI 可分为三个结构域，N 端和 C 端结构域的整体拓扑结构与 II 型 RE 家族的常见结构核心相似，中央结构域则与已知结构无明显相似性。通过结构比较，还发现了 BsmI 与其他限制性内切酶在结构上的同源性。
- 活性 BsmI 结构与金属离子位置：在有 Ca2+存在的条件下，获得了活性 BsmI（wt.BsmI）与同源 DNA 的晶体。与 N0.BsmI 结构相比，wt.BsmI 中 DNA 更深地嵌入结合凹槽，且存在一个可移动的 “绝缘环”。同时，wt.BsmI 结构显示两个活性位点中存在三个钙离子，其位置与 BamHI 活性位点的金属离子位置有相似之处。
- 突变体结构与切割机制：解析 Nt.BsmI 和 Nb.BsmI 突变体与 DNA 底物的复合物结构发现，Nb.BsmI 在切割底部链后，DNA 未发生明显构象变化；Nt.BsmI 在底部链有切口时可切割顶部链，表明 DNA 切割是有序进行的，底部链切割是顶部链切割的必要步骤。
- DNA 识别机制：BsmI 识别的 DNA 序列位于略微扭曲的 DNA 螺旋上，这种扭曲与绝缘环的闭合有关。中央结构域在序列识别特异性中可能起重要作用，蛋白质与 DNA 的相互作用涉及多个方面，包括与磷酸基团、核糖部分以及碱基的相互作用。
- 保守基序与关键残基功能：通过序列比对和保守性分析，确定了 BsmI 序列中的保守基序，这些基序与催化、金属离子配位、DNA 结合特异性等功能相关。
- 切割机制验证：通过对 BsmI 突变体的活性测试，进一步证实了两条 DNA 链的切割是有序、协同的过程。此外，研究还发现 BsmI 对硫代磷酸酯键的切割具有立体特异性，且正常模式分析揭示了酶切割顶部链时可能的构象变化机制。
研究结论和讨论部分指出，该研究首次解析了具有两个活性位点的单体 II 型限制性内切酶的高分辨率结构。研究发现 BsmI 切割 DNA 的顺序是先切割底部链，再切割顶部链，可能是通过一种有序且协同的机制进行。Alphafold 3 虽然在预测 BsmI 的结构方面有一定成果，但在预测其与 DNA 的相互作用时存在错误，表明晶体结构在研究蛋白质与 DNA 相互作用的原子细节方面仍不可或缺。同时，wt.BsmI 的晶体有望用于未来的时间分辨晶体学研究，以进一步揭示其切割反应的详细步骤。此外，研究还为合理设计活性顶部链切割酶提供了思路，例如通过稳定顶部链切割结构域与 DNA 的相互作用，或对绝缘环进行工程改造等方式，为后续的酶工程研究奠定了重要基础。
