解析辣根过氧化物酶（HRP）晶体结构，开启生物无机化学新篇

研究人员为解决辣根过氧化物酶（HRP）结晶难题，重组表达并解析其铁离子形式晶体结构，为后续研究奠基。

　　辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）在生命科学研究领域可是个 “明星分子”。早在 19 世纪初，人们就发现了辣根植物中的过氧化物酶活性，那时候，它就像一个神秘的宝藏，吸引着无数科研人员去探索。HRP 能够高效氧化小分子芳香底物，催化产生容易检测的有色或荧光产物，这一特性让它成为生物技术检测中极为灵敏的诊断工具。

然而，HRP 的研究之路并非一帆风顺。从辣根根部提取的天然 HRP 高度糖基化，这一特性使得它在长达几十年的时间里都难以结晶，就像给科研人员设置了一道难以跨越的障碍。虽然 HRP 的酶活性在近 200 年前就被发现了，但由于从天然来源中分离单一同工酶困难重重，并且在重组大肠杆菌表达系统中，从不可溶性包涵体中重折叠 HRP 的产量极低，导致目前已发表的 HRP 晶体结构少之又少。与其他过氧化物酶相比，例如细胞色素 c 过氧化物酶在蛋白质数据库（PDB）中有超过 200 个结构，HRP 的结构信息严重匮乏。面对这些困境，科研人员并没有放弃，为了深入了解 HRP 的结构与功能，打破研究瓶颈，来自英国布里斯托大学、维也纳技术大学、莱斯特大学等机构的研究人员 Mst Luthfun Nesa、Suman K. Mandal 等开展了一项重要研究，相关成果发表在《JBIC Journal of Biological Inorganic Chemistry》杂志上。

研究人员采用了多种关键技术方法来开展研究。在蛋白质制备方面，利用改进的从大肠杆菌包涵体重折叠重组 HRP 的方法，获得了可用于后续实验的纯重组非糖基化 HRP。在晶体培养上，运用坐滴气相扩散法，先从先前报道的条件进行结晶尝试，之后通过微籽晶技术优化晶体生长。对于晶体结构的解析，则使用 X 射线衍射技术收集数据，借助 autoPROC、XDS 等软件处理数据，采用分子置换法解析结构，并利用 PHENIX 和 Coot 软件进行模型构建和精修。

下面来看看具体的研究结果：

• 光谱和稳态动力学分析：通过对重组 HRP 进行电子光谱和稳态动力学分析，发现重组铁离子形式的 HRP 在 403nm 处有 Soret 最大值，这表明其为铁离子高自旋血红素，且该光谱与先前报道的天然野生型 HRP 及其他不同方法制备的重组野生型 HRP 一致。在稳态氧化愈创木酚实验中，重组 HRP 的kcat?=304±99 s?1 、Km?=3.23±1.50mM，与之前报道的值相符。
• 晶体生长条件探索：过去，HRP 晶体只能在非常有限的条件下获得，而现在研究人员利用开发的筛选试剂，探索出了多种可产生适合 X 射线研究晶体的条件。
• 晶体结构解析：解析得到的 HRP 晶体结构包含 306 个残基，有 15 个 α - 螺旋（148 个残基）和 2 个反平行 β - 折叠（6 个残基）。结构中存在四个二硫键，在 III 类过氧化物酶中高度保守；还有两个钙离子，但不在活性位点附近。在血红素活性位点，有近端配体 His 170、远端 His 42 和 Arg 38。令人惊讶的是，活性位点存在一个乙二醇分子，它与 His 42 和 Arg 38 形成氢键，但不与血红素铁相互作用。同时，在活性位点没有发现远端水分子，也没有像之前在其他 HRP 结构中观察到的阿魏酸结合。

研究结论和讨论部分意义重大。研究人员成功获得了重组 HRP 的晶体，并解析出其铁离子形式的高分辨率晶体结构，这为 HRP 的研究提供了重要的结构基础。活性位点中乙二醇分子的发现，引发了对阿魏酸在结晶过程中去向的思考，可能是由于新的结晶条件或冷冻保护过程中被乙二醇取代。此外，在更广泛条件下成功结晶 HRP，为优化晶体的大小和形态提供了可能，有助于未来进行 X 射线自由电子激光（XFEL）和中子衍射实验，进一步探索 HRP 标志性的化合物 I 和化合物 II 反应中间体的性质和反应活性。这一系列成果为深入理解 HRP 的催化机制、底物结合模式以及在生物技术和生物化学领域的应用开辟了新的道路，有望推动相关领域的进一步发展。