利用表面展示技术高效生物合成香草醛：开辟绿色生产新路径

为解决香草醛生物合成难题，研究人员构建 LOAS - ELNS 系统，高效合成香草醛，提供新方法。

　　

利用表面展示技术高效生物合成香草醛：开辟绿色生产新路径

在食品和制药领域，香草醛作为一种广泛应用的风味化合物，有着不可替代的地位。它就像一位 “调味皇后”，能为各种产品增添独特的风味。天然香草醛提取自香草豆荚，不仅具有独特的化学性质，还具备抗菌、抗诱变和抗氧化等特性，可作为生物防腐剂使用。然而，香草植物对生长环境要求苛刻，天然香草醛产量极低，无法满足市场需求。

化学合成香草醛虽成本低、产量高，但其使用的底物和生产过程会对环境和人体健康造成不良影响，在食品行业的应用逐渐受限。因此，寻找一种高效、环保且可持续的香草醛生产方法迫在眉睫。

为了解决这些问题，浙江工业大学等机构的研究人员开展了深入研究。他们构建了一种混合表面展示生物催化系统，相关研究成果发表在《Microbial Cell Factories》上。

研究人员在此次研究中运用了多种关键技术方法。在构建展示系统时，利用基因工程技术，将相关基因进行克隆和表达，构建了多种质粒用于后续实验。采用共聚焦荧光显微镜技术，直观地观察蛋白在细胞表面的展示情况。通过 SDS - PAGE 和 Western blot 分析，验证目标蛋白的表达和复合物的形成。使用 HPLC 技术检测反应底物和产物，从而分析酶的活性和反应进程。

评估共展示系统性能

研究人员将 Lpp - OmpA（LOA）与 SpyCatcher 融合作为内源性锚定基序，利用 SpyTag 融合目标蛋白。通过构建含有不同荧光蛋白基因的质粒，转化大肠杆菌 BL21 (DE3)，并进行诱导表达。共聚焦荧光显微镜观察发现，mCherry - SpyTag 能与 Lpp - OmpA - sfGFP - SpyCatcher 形成共价键复合物并转运到细胞表面。同时，设计了 HRV 3C 蛋白酶识别位点，进一步验证了 Lpp - OmpA - sfGFP - SpyCatcher 成功展示在细胞表面，表明研究人员成功构建了共展示平台。

构建 EUGO 和 NOV1 共展示系统

从 Rhodococcus jostii RHA1 中获取的丁香酚氧化酶（EUGO），能以多种 4 - 取代酚类为底物，且具有出色的溶剂耐受性；从 Novosphingobium aromaticivorans DSM 12444 中获得的双加氧酶（NOV1），可将木质素衍生化合物转化为香草醛，且无需昂贵的辅助因子。研究人员将优化密码子后的 EUGO 和 NOV1 分别连接到表达载体上，转化大肠杆菌 BL21 (DE3)，诱导表达后纯化蛋白，通过 SDS - PAGE 和 HPLC 分析，证实 EUGO 和 NOV1 单独表达时有生物活性。之后，利用上述共展示系统，将 EUGO 和 NOV1 共展示在大肠杆菌 BL21 (DE3) 细胞表面，成功构建了香草醛生物转化系统。

优化 LOAS - ELNS 表面展示系统

成功构建系统后，研究人员对其生产条件进行优化。对比不同菌株的生长曲线，发现 LOAS - ELNS 展示系统在 12 小时内对细胞生长无影响。通过 SDS - PAGE 分析不同诱导温度下的蛋白表达情况，结合酶活性测定，确定 25℃为后续研究中 LOAS - ELNS 系统的最佳表达温度。

优化 LOAS - ELNS 系统的生物合成效率

研究人员系统分析了温度、pH 值、DMSO 浓度、LOAS - ELNS 细胞量和 4 - PG 浓度等参数对反应的影响。结果表明，30℃时 LOAS - ELNS 展示细胞的酶活性最高；pH 8.0 时，香草醛产量较高且能减少细胞裂解；细胞密度为 30 g cww/L 时，香草醛产量最佳；DMSO 浓度为 7.5% (v/v) 时，最终产物香草醛浓度最高；0.5 mM 4 - PG（16.622 g/L）为最佳底物浓度。在此条件下，LOAS - ELNS 系统生产香草醛的产量达到 12.58 g/L，是全细胞催化系统的 2.5 倍，4 - PG 到香草醛的最终转化率达到 83.4%。

评估 LOAS - ELNS 展示系统的可重复使用性

催化剂的重复使用和再生是降低催化成本的有效策略。研究人员对 LOAS - ELNS 展示细胞进行 15 轮酶活性实验，发现该细胞在优化条件下可成功重复使用 3 次，活性保持在初始活性的 92% 以上；可重复使用 10 次，活性保持在 70% 以上。多次使用后活性下降，部分原因是反应中产生的过氧化氢等有害副产物影响了酶活性，但整体结果表明该系统具有良好的可重复使用性。

研究人员构建的混合生物合成系统，利用大肠杆菌内源性锚定基序 Lpp - OmpA 和 SpyTag/SpyCatcher 蛋白对系统，展示 EUGO 和 NOV1 复合物，以木质素衍生的 4 - n - propylguaiacol（4 - PG）为原料生产香草醛。通过优化催化条件，香草醛产量显著提高，且该系统可重复使用。这一研究成果为生物基香草醛的可持续生产提供了重要基础，有望推动香草醛生产行业向绿色、高效的方向发展，为解决香草醛生产难题提供了全新的思路和方法，具有重要的理论意义和实际应用价值。未来，研究人员还将进一步优化该系统，提升其性能，为实现香草醛的工业化生产奠定更坚实的基础。