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为解决野外植物转录组研究难题，研究人员评估相关方法，发现现场提取优势，为植物研究提供新途径。
在植物的奇妙世界里，它们为了适应干旱、洪涝、温度变化等各种环境条件，会悄悄在基因层面做出改变，通过调整新陈代谢来应对挑战。研究植物的基因表达变化，就像是解锁植物适应环境的密码，其中转录组学研究至关重要。转录组学能够展示特定时间和环境下植物基因的表达水平，尤其是在研究非模式植物时，它无需预先了解基因组信息，成为了科学家们的得力工具。
然而，目前的 “野外转录组学” 研究却面临诸多困境。RNA 非常 “娇弱”，极易受到外界刺激而降解，所以在野外研究时，样本需要用液氮速冻并保持冷链运输。但这在偏远的沙漠、山区和雨林等地几乎难以实现，因为运输液氮不仅危险，而且维持冷链需要稳定的电力供应，这些地方往往离装备完善的实验室很远。另外，现有的植物 RNA 提取和存储方法也存在不足，多数只关注 RNA 的数量、质量和纯度，却忽略了对转录组的全面评估。例如常用的 RNA 完整性数（RIN），它是基于哺乳动物数据开发的，在植物研究中可能会因为植物细胞中额外的叶绿体核糖体 RNA 条带，导致 RIN 值被低估，无法准确反映 mRNA 的完整性。
为了突破这些困境，来自山形大学研究生院、庆应义塾大学先进生物科学研究所等机构的研究人员，开展了一项极具意义的研究。他们以非模式植物东方藜芦（Helonias orientalis）为研究对象，对植物组织存储和现场 RNA 提取方法进行了全面评估，相关研究成果发表在《Journal of Plant Research》上。
研究人员采用了多种关键技术方法来开展研究。在样本处理上，将东方藜芦从自然栖息地移植到实验室培养，待合适时机进行 RNA 提取实验。对于 RNA 提取和存储，设置了不同的处理组，包括使用 RNAlater 和 TRIzol 两种保存溶液，在不同时间（1 天和 14 天）、不同温度（室温 25°C）下保存植物组织，同时对比了三种基于便携式设备的现场 RNA 提取方法（TR、CT、CC）和传统的 TRIzol 提取方法。在后续分析中，运用 mRNA 文库制备和测序技术获得转录组数据，通过转录组分析评估不同处理组的转录组质量，包括检查转录组统计数据、将 reads 映射回组装结果以及使用 BUSCO 评估转录组完整性，还进行了差异表达分析和基因本体富集分析来探究基因表达变化及生物学意义，最后通过 RT-qPCR 验证转录组分析结果。
研究结果主要体现在以下几个方面：
- RNA 产量和质量：RNAlater 和 TRIzol 保存 1 天和 14 天对东方藜芦叶片总 RNA 产量无影响，但会影响 RNA 质量。RNAlater 保存 14 天 RIN 值从 6.4 降至 5.2，TRIzol 保存 1 天 RIN 值从 7.7 降至 5.5，14 天降至 2.1。现场提取方法中，CT 方法 RNA 产量显著更高，TR 和 CT 的 RIN 值与 TRIzol 对照无显著差异，CC 方法则出现明显 RNA 降解12。
- 从头转录组组装：研究发现，用 RNAlater 或 TRIzol 保存植物组织 1 天，对转录组组装的整体质量影响不大，但保存 14 天会导致组装碎片化，BUSCO 完整性低于 80% ，N50 长度和组装转录本总数减少。而现场提取方法的转录组组装结果与对照差异较小，N50 值在 1346 - 1397 nt 之间，BUSCO 完整性得分在 87.7 - 89.8% 之间，表明现场提取方法的转录组组装效果令人满意34。
- 差异表达分析和基因本体富集分析：随着保存时间延长，RNAlater 和 TRIzol 中下调基因数量增加。现场提取方法的差异表达基因数量总体优于存储方法。存储在 RNAlater 中会导致光合作用上调，对酸化学、盐和水的响应下调；存储在 TRIzol 中会减少细胞内蛋白质运输的转录丰度。现场提取方法中，基于 CTAB 的 CT 和 CC 方法会增加光合作用和羧酸代谢过程相关转录本的丰度56。
研究结论和讨论部分意义重大。研究表明，RIN 在植物转录组学研究中存在局限性，它只是一个参考指标，不能完全代表转录组质量，转录组分析才是评估存储和提取方法的关键。RNAlater 和 TRIzol 在室温下保存植物组织 2 周，会导致转录组完整性低，差异表达基因比例高，不适用于长时间野外研究，但在短于 24 小时的野外工作中可能有用。三种现场 RNA 提取方法（TR、CT、CC）各有特点，虽然存在一些需要改进的地方，如 RNA 纯度不理想等，但总体可以作为替代方法。其中 CC 方法对富含次生代谢物的植物更友好，在偏远地区更具实用性。研究人员还建议在野外提取 RNA 后进行 DNase 消化和逆转录，认为 cDNA 在室温下至少能稳定存在两周，方便样本运输。总之，该研究为野外植物转录组研究提供了重要参考，帮助科研人员根据研究目的和野外条件选择合适的实验方案，推动了植物在自然环境下转录调控机制的研究进展。
