靶向 CARM1 和 IKZF3 的双重抑制剂治疗多发性骨髓瘤的研究进展

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　　多发性骨髓瘤（MM）的治疗现状与挑战
多发性骨髓瘤（MM）是一种克隆性浆细胞恶性肿瘤。随着免疫调节药物（IMiDs）、蛋白酶体抑制剂以及抗体、嵌合抗原受体 T 细胞疗法等的出现，MM 患者的 5 年生存率有所提高，达到 49% - 56%。然而，耐药问题依旧存在，寻找新的治疗方法以实现更持久的缓解迫在眉睫。

CARM1 的生物学功能及在 MM 中的作用
共激活因子相关精氨酸甲基转移酶 1（CARM1）作为一种蛋白质精氨酸甲基转移酶，可催化甲基从 S - 腺苷甲硫氨酸转移到精氨酸残基的侧链氮上，使底物蛋白形成不对称二甲基精氨酸。CARM1 通过对众多底物的甲基化作用，参与细胞分化、细胞周期调控、转录共激活和 RNA 加工等多种细胞功能。在 MM 细胞中，CARM1 高表达，且与不良预后密切相关。CARM1 抑制剂，如 EZM2302，在体外 MM 细胞系实验中展现出抗增殖活性，在小鼠 MM 肿瘤异种移植模型中也能剂量依赖性地抑制肿瘤生长，这表明 MM 细胞对 CARM1 存在依赖。不过，CARM1 抑制剂在 MM 中的作用机制尚未完全明晰，虽然有研究认为激活 p53 信号通路可能是其发挥致死效应的原因之一，但仍需进一步探究。

免疫调节药物（IMiDs）的作用机制及耐药问题
免疫调节药物（IMiDs），包括来那度胺、沙利度胺和泊马度胺，在 MM 及其他 B 细胞恶性肿瘤的治疗中具有临床疗效。目前，泊马度胺是经来那度胺和蛋白酶体抑制剂治疗后复发 / 难治性 MM 患者的标准治疗药物，它常与地塞米松联合使用，二者协同发挥强大的治疗作用，且正在作为四联疗法的一部分与新型药物进行临床评估。IMiDs 的作用机制主要是通过直接结合 cereblon（CRBN），使 CRBN 在 CRL4 E3 泛素连接酶复合物中决定底物特异性，从而导致 IKZF1 和 IKZF3 靶向泛素化和降解。通过激活 IKZF1 和 IKZF3 的蛋白酶体降解，结合免疫调节、抑制血管生成以及破坏 MM 细胞与骨髓基质的相互作用等效应，泊马度胺展现出强大的抗 MM 活性。
然而，IMiD 耐药是一个棘手的临床问题。研究发现，MYC 水平升高与 IMiD 耐药相关，且在部分（22%）IMiD 耐药的 MM 患者中存在 CRBN 异常，包括 CRBN 及相关基因的获得性突变。CRBN 缺失和 MYC 上调均预示着不良预后。

CARM1 抑制与 IMiDs 联合治疗 MM 的协同作用
为提高 IMiD 治疗诱导的 IKZF1 和 IKZF3 降解效果，研究人员将 CARM1 抑制剂 EZM2302 作为联合治疗的潜在药物进行研究。研究发现，IKZF3 和 CARM1 是 MM 细胞中独立的依赖性因子，且与其他癌症存在差异。用 CARM1 抑制剂 EZM2302 分别与靶向 IKZF3 的泊马度胺或来那度胺联合处理 H929 和 8226 MM 细胞系 6 天，结果显示联合治疗增加了细胞对药物的敏感性，剂量 - 反应曲线左移，组合指数表明在一系列浓度下联合治疗具有协同作用。同时，联合治疗对 MM 细胞的作用具有通路特异性，泊马度胺可降解其已知蛋白靶点 IKZF1 和 IKZF3，但不会使 BAF155（CARM1 的已知底物）去甲基化；EZM2302 则导致甲基化 BAF155 浓度依赖性降低，而不影响 IKZF1 或 IKZF3 的蛋白水平。
进一步研究发现，联合治疗协同效应的介导因素可能与 IKZF3 和 MYC 有关。在所用浓度下，单独使用两种药物对 MYC 蛋白水平影响不显著，但联合治疗的 H929 和 8226 细胞中 MYC 蛋白水平下调更明显，同时 IKZF3 的下调也有所增加。此外，在 H929 细胞中，强力霉素诱导的 CARM1 基因敲低（KD）显著增强了泊马度胺的抗增殖作用，而强力霉素诱导的 IKZF3 KD 也增强了 EZM2302 的抗增殖作用。过表达 IKZF3 可部分挽救 H929 细胞免受泊马度胺的抗增殖作用，以及 EZM2302 和泊马度胺联合治疗的协同效应。这些结果验证了 EZM2302 靶向 CARM1 和泊马度胺靶向 IKZF3 对联合治疗协同效应的贡献，表明 IKZF3 和 MYC 在 EZM2302 与泊马度胺的协同作用中至少部分发挥了效应子的作用。

新型双功能分子 074 的设计与活性研究
研究人员旨在设计一种双功能的泊马度胺 / EZM2303 嵌合小分子药物，期望获得具有靶向降解 CARM1 功能的蛋白水解靶向嵌合体。他们合成并筛选了一系列针对 MM 细胞系的二元化合物，这些化合物主要在连接区和 E3 结合片段（靶向 CRBN 或 VHL）有所不同。最终确定化合物 070 和 074 为最具潜力的有效双靶向 CARM1 和 IKZF3 的药物，不过它们并不具备降解 CARM1 的能力。值得注意的是，074 在酶活性测定中仍能抑制 CARM1，其半数最大抑制浓度（IC₅₀）为 2 nM，这表明连接区不影响 CARM1 配体活性。
用设计的双价化合物 070 和 074（由 EZM2302 和泊马度胺组成）处理人 MM 细胞系，包括 H929、MM.1S 和 U266，结果显示它们能选择性杀伤转化细胞，对正常骨髓细胞和正常外周血单核细胞（PBMCs）几乎没有杀伤作用，且对 MM 细胞的杀伤效力比单独使用 EZM2302 或泊马度胺更强。074 对 H929 细胞生长的抑制作用比 EZM2302 和泊马度胺联合使用时更显著，这表明除了协同作用外，可能还有其他因素有助于该药物的疗效。8226 细胞对 IMiD 具有内在抗性，IMiD - EZM2302 联合治疗需要更高浓度的两种化合物（比 H929 细胞所需浓度高 100 倍），但 074 对 8226 细胞的 IC₅₀约为 1000 nM，这个浓度对正常骨髓细胞或正常 PBMCs 的毒性极小。此外，表达突变 p53 的 8226 和 U266 细胞系对 074 有一定敏感性，而表达野生型 p53 的 H929 和 MM.1S 细胞对 074 的敏感性相对更高。
研究还发现，074 处理 H929 细胞 4 天后，通过 Annexin V 和碘化丙啶（PI）染色及流式细胞术检测发现，凋亡和坏死细胞的百分比呈浓度依赖性增加。070 和 074 处理 H929 和 8226 细胞后，甲基化 BAF155 水平下降，这与 EZM2302 处理的效果相似，而泊马度胺处理则无此现象，表明 070 和 074 能靶向抑制 CARM1。同时，070 和 074 处理 H929 和 8226 细胞后，IKZF1、IKZF3 和 MYC 的蛋白水平在 2 - 24 小时内迅速下调。虽然 074 处理 8226 细胞时对 Ikaros 蛋白的影响比处理 H929 细胞时更温和，但 074 对 H929 或 8226 细胞中 CARM1 蛋白水平几乎没有影响。
进一步研究发现，074 处理 H929 细胞 24 小时后，MYC 转录本下调；EZM2302 和泊马度胺联合处理 4 小时后，MYC 转录本的下调程度比单独使用任何一种药物时更大。此外，对 MM 细胞生存至关重要且调节 MYC 的干扰素调节因子 4（IRF4），在 074 处理 24 小时后也下降，EZM2302 和泊马度胺联合处理 4 小时后同样下降更明显。这些结果表明，074 或 CARM1 抑制剂与泊马度胺联合治疗导致的 MYC 蛋白下调可能涉及转录和翻译两个层面的调控。

074 的作用靶点及 CRBN 依赖性验证
通过蛋白质组学分析 074 处理 8 小时和 24 小时的情况，以进一步验证 074 中 IMID 的靶向活性。结果鉴定出 IKZF1、IKZF3、ZFP91 和 FGD3 为主要的蛋白质降解靶点，但未发现 CARM1。与单独使用泊马度胺或 EZM2302 相比，双靶向 CARM1/Ikaros 的药物 074 能更有效地下调 IKZF3、IKZF1 和 MYC，同时 074 对其他鉴定出的靶点，如 ZFP91（来那度胺和泊马度胺的已知底物，与 IMiD 耐药相关）和 FGD3（参与肌动蛋白细胞骨架重组和细胞形态改变）的降解作用也更强。不过，FGD3 基因敲低（KD）对 H929 细胞的生长或活力没有影响，且 DepMap 数据库查询显示 FGD3 不是 MM 细胞系中的疾病特异性依赖性基因。处理 074 8 小时后，与 Ikaros 类似能结合 CRBN 的 G1 到 S 期转换 1（GSPT1）蛋白水平未发生变化。总之，这些结果表明 074 能作用于大多数已报道的来那度胺 / 泊马度胺的降解靶点。
为证实 074 诱导的蛋白质下调是通过 CRBN 依赖性途径发生的，研究人员对 MM.1S 亲本细胞和 MM.1S CRBN 基因敲除（KO）细胞进行了为期 5 天的 074 处理实验。结果显示，100 nM 的 074 对亲本 MM.1S 细胞的生长抑制率超过 50%，效力比泊马度胺更强，但对 MM.1S CRBN KO 细胞的杀伤作用明显减弱。这种效力差异与 CRBN 介导的蛋白质组学分析确定的 074 主要靶点的降解相关。此外，通过比较 074 与失去 CRBN 结合亲和力的修饰版本 MTG - 3 - 141 的抗增殖作用，进一步验证了 074 对 CRBN 的依赖性。在增殖实验中，074 对 H929 细胞的效力明显高于 MTG - 3 - 141。074 能有效降解蛋白质组学分析确定的主要靶点，而 MTG - 3 - 141 处理 H929 细胞后，这些蛋白质的降解不明显。虽然 074 和 MTG - 3 - 141 对 CARM1 蛋白水平影响较小，但 MTG - 3 - 141 和 074 一样能有效使 BAF155 去甲基化，表明其保留了 CARM1 抑制活性。综合这些结果表明，074 对 IKZF3 的靶向降解依赖于泊马度胺部分，因此是 CRBN 依赖性的。

074 克服 IMiD 耐药的研究
由于 074 在细胞系模型中的疗效优于单独使用泊马度胺，且 IMiD 耐药是临床面临的难题，研究人员测试了 074 对泊马度胺耐药的 H929 细胞的疗效。研究发现，与 H929 DMSO 对照细胞相比，泊马度胺耐药的 H929 细胞中 CRBN 水平较低，IKZF3 和 MYC 蛋白表达略有升高，这与之前报道的 IMiD 耐药相关蛋白变化一致。用 EZM2302 和泊马度胺联合处理 H929 DMSO 对照细胞和 IMiD 耐药的 H929 细胞，剂量 - 反应曲线左移，表明联合治疗有效，且联合治疗对 IMiD 耐药的 H929 细胞的疗效与泊马度胺对 H929 DMSO 对照细胞的疗效相近。虽然 IMiD 耐药细胞对 074 的敏感性低于 H929 DMSO 对照细胞，但 074 对 IMiD 耐药的 H929 细胞的疗效与泊马度胺对 H929 DMSO 对照细胞的疗效相同。这些结果表明，CARM1 抑制剂与泊马度胺联合治疗或 074 治疗在一定程度上可使细胞对泊马度胺重新敏感，且 074 的活性不仅依赖于 IMiD 活性，还依赖于 CARM1 抑制来抑制细胞生长。

研究展望与挑战
本研究证实了靶向 MM 细胞对 CARM1 的依赖性可增强 IMiDs 的抗 MM 活性，CARM1 抑制与 IMiD 治疗联合对 MM 细胞具有协同作用，且这种协同作用可通过新型小分子抑制剂 074 模拟。074 能同时保留 CARM1 抑制和泊马度胺的活性，有效抑制 MM 细胞生长，且对正常细胞毒性较小，还能克服 IMiD 耐药。然而，目前仍有许多问题有待进一步研究。
虽然研究表明 074 对 MM 细胞的作用涉及转录和翻译层面调控 MYC，但 CARM1 在 MM 中的作用机制尚未完全明确，尤其是 CARM1 依赖性机制在 MM 中的具体情况。未来研究可聚焦于确定 MM 细胞中对 CARM1 抑制敏感或耐药的特定基因型或突变负担，以及相关的潜在机制。此外，由于 MYC 在癌症发生发展中起着核心作用，且与 SWI/SNF 信号通路相关，探索直接或间接靶向调节 MYC 的 SWI/SNF 复合物亚基，以增强 IMiDs 对 MM 的治疗效果，也是一个有前景的研究方向。
在药物研发方面，虽然 074 在体外研究中展现出良好的效果，但在体内研究中存在局限性，如生物利用度有待优化。未来需要通过化学优化，提高 074 的体内性能，以便进行异种移植和 PDX 研究，评估其在体内的疗效和安全性。
另外，MM 患者中 TP53 异常与难治性疾病和不良预后相关。虽然 074 能以浓度依赖性方式杀伤表达突变 p53 的细胞系，但对这些细胞系的疗效不如对表达野生型 p53 的细胞系。对于 TP53 异常的患者，将 074 与 p53 靶向药物和 / 或其他能够克服因突变 p53 导致的耐药的促凋亡药物联合使用，可能会实现更大的临床获益，这也需要进一步的研究验证。

综上所述，本研究为 MM 的治疗提供了新的思路和潜在的治疗策略，074 作为一种新型药物展现出了良好的应用前景，但仍需要更多的研究来深入了解其作用机制、优化药物性能，并探索最佳的临床应用方案。}