盐诱导激酶（SIKs）在胰腺内分泌细胞命运决定中的新作用

这篇研究发现 SIKs 是 F-actin 触发 YAP1 活性变化的介质，可促进胰腺内分泌细胞分化。

　　

1 型糖尿病与胰腺内分泌细胞分化研究背景

1 型糖尿病（T1D）是一种自身免疫性疾病，患者体内的 β 细胞会被选择性破坏，导致严重的胰岛素缺乏，患者需要每天注射胰岛素来维持生命。理论上，人类多能干细胞（hPSCs）有望成为功能性 β 细胞的无限来源，为众多 T1D 患者带来新的治疗希望。将 hPSCs 分化为 β 细胞，需要借助重组蛋白和化学物质，精确调控特定发育途径的激活与抑制，引导 hPSCs 逐步经过确定内胚层、原始肠管、后前肠、双能胰腺祖细胞（bi-PPs）、内分泌祖细胞（EP）和内分泌细胞等阶段。

在这个过程中，PDX1⁺NKX6.1⁺bi-PPs 具有分化为导管细胞或内分泌细胞谱系的潜力。目前，大多数成熟的实验方案能够在体外稳定且高效地培养出 bi-PPs，但由于对 bi-PPs 向 EPs 分化的调控机制了解不足，导致这一阶段的分化效率并不理想。

此前研究发现，F - 肌动蛋白（F-actin）动力学，比如细胞与细胞外基质（ECM）黏附时产生的变化，能够通过 Yes 相关蛋白 1（YAP1）-Notch 机械信号通路，自主控制 bi-PPs 的命运。具体来说，肌动蛋白解聚会降低细胞核中 YAP1 的水平，减少 HES1 表达，进而促进 EP 分化。不过，F-actin 调节 bi-PPs 中核 YAP1 活性的具体机制仍不明确。本研究旨在揭示这一机制，发现盐诱导激酶（SIKs）在其中发挥关键作用，为提高 hPSC 来源的 bi-PPs 向内分泌细胞的转化效率提供了新途径。

SIKs 在肌动蛋白解聚诱导内分泌细胞分化中的作用

为了探究肌动蛋白解聚触发内分泌细胞分化的分子机制，研究人员用肌动蛋白解聚药物 Latrunculin B（LatB）处理 PDX1⁺NKX6.1⁺bi-PPs。在处理后的多个时间点（3、6、12 和 24 小时）收集样本，进行批量 RNA 测序分析，以确定 F-actin 靶向的、触发 EP 分化的基因，未处理的样本作为对照。

分析内分泌细胞标记基因的表达情况发现，早期 EP 标记基因，如NEUROG3、INSM1、ISL1和NEUROD1，在 LatB 处理 6 小时后表达增加。进一步聚焦于 LatB 处理 3 小时的样本，分析发现蛋白激酶SIK2是此时上调最显著的基因。在差异调节最大的前 10 个激酶中，SIK1B、SIK2和SIK3都显著上调，这表明 SIKs 可能与内分泌发生密切相关。通过 qPCR 和蛋白质免疫印迹分析验证，发现SIK1B、SIK2和SIK3的表达确实增加，且 SIK3 蛋白水平在 LatB 处理 3 - 6 小时后上升。这些结果表明，SIKs 在 F-actin 动力学影响内分泌发生的过程中，处于下游发挥作用。

氯化钠处理促进内分泌发生与 SIK 表达的关系

SIKs 可被钠稳态激活。研究人员用不同浓度的氯化钠（NaCl）处理细胞，发现 180 mM NaCl 处理 12 小时可促进SIK3表达，200 mM NaCl 处理则可同时促进SIK1和SIK3表达，蛋白质免疫印迹分析也证实了 200 mM NaCl 处理后 SIK3 蛋白水平增加。

基于此，研究人员用 200 mM NaCl 处理细胞 12 小时，以探究 SIK 表达增加是否会促进 EP 分化。结果显示，处理后NEUROG3表达增加，免疫荧光和流式细胞术分析表明，NaCl 处理后 NEUROG3-GFP⁺ EPs 的比例和数量都有所增加。

进一步将 NaCl 处理后的细胞在标准培养基中继续培养 4.5 天，流式细胞术检测发现，NaCl 处理组的 NEUROG3-GFP⁺内分泌细胞数量显著高于未处理组，同时INS和GCG的表达水平上调，β 细胞数量增加了 1.5 倍。这些结果表明，NaCl 处理能够增强胰腺内分泌谱系的定向分化，而其潜在机制可能是 SIK 表达的增加。

SIKs 促进内分泌细胞分化的机制及验证

研究人员之前发现，机械敏感的 YAP1 可通过直接结合NEUROG3启动子抑制其表达。为了探究 SIKs 是否通过降低核 YAP1 水平促进内分泌细胞分化，研究人员在 LatB 处理的细胞中使用 pan-SIK 抑制剂 HG-9-91-01（HG）抑制 SIK 活性。结果发现，LatB + HG 处理的细胞中NEUROG3表达水平低于仅用 LatB 处理的细胞，这是因为 HG 处理后核 YAP1 水平恢复，同时 YAP1 靶基因CTGF和NUAK2的表达增加，表明 SIKs 的促内分泌发生功能是通过降低核 YAP1 水平来实现的。

有趣的是，有研究报道延长 HG 处理会通过负反馈机制增加 SIK 转录，本研究也证实了这一点。基于此，研究人员推测在处理 12 小时后去除 HG，会因 SIK 表达增加而增强内分泌细胞分化。实验结果显示，去除 LatB 和 HG 后，SIK3 蛋白水平显著升高且至少持续 12 小时，核 YAP1 水平降低，EP 标记基因NEUROG3和NEUROD1表达显著增加，到分化第 24 天，NEUROG3-GFP⁺内分泌细胞数量显著高于未处理组和 LatB 处理组。单独用 HG 处理 12 小时也有类似效果，这些数据表明 SIKs 是内分泌分化所必需的。

为了在体内验证这一结论，研究人员用 LatB + HG 处理 E11.5 胰腺外植体 1 天，然后去除药物继续培养 2 天。结果发现，处理组中Neurog3、Ins和Gcg的表达水平显著高于未处理对照组，Neurog3和Gcg的表达水平也高于 LatB 处理组。全组织免疫荧光分析显示，LatB + HG 处理显著增加了 INS⁺ β 细胞和 GCG⁺ α 细胞的生成。这一系列结果表明，增加 SIK1 和 SIK3 表达可通过降低核 YAP1 水平促进内分泌发生。

SIK 表达增加对功能性 β 细胞生成的影响

研究人员为了探究 LatB + HG 处理后的 EPs 是否能进一步分化为功能性 β 细胞，将分化方案延长至第 35 天。结果显示，LatB + HG 处理组的 β 细胞数量（25.35% ± 3.43%）显著多于未处理组（10.75% ± 2.48%）和 LatB 处理组（20.10% ± 4.37%），且细胞表达 β 细胞的特征标记物。

由于 β 细胞数量增加，LatB + HG 处理组的胰岛素含量也高于其他两组。此外，LatB + HG 处理组的 β 细胞在高葡萄糖和 exendin - 4 刺激下会分泌 C 肽，但三组的葡萄糖刺激指数没有显著差异，这表明 LatB 和 HG 处理虽能促进 β 细胞分化，但对 β 细胞成熟的改善效果不明显。总体而言，LatB + HG 处理后 SIK 表达增加，能够促进产生对葡萄糖有反应的 β 细胞。

研究成果的意义与展望

以往研究表明，ECM 相互作用的变化可通过 F-actin - YAP1 - Notch 机械信号轴控制 bi-PP 的命运，但 F-actin 动力学调节核 YAP1 水平的具体机制一直不明确。本研究首次发现 SIKs 是 F-actin 动力学在 bi-PPs 向 EPs 分化过程中的关键下游介质。肌动蛋白解聚诱导 SIK 表达增加，进而降低核 YAP1 水平，增强NEUROG3表达。通过药物诱导 SIK 表达，能够促进内分泌发生和功能性葡萄糖反应性 β 细胞的生成。

YAP 是机械转导中的关键效应因子，在多个器官的发育过程中，控制着由机械信号驱动的基因表达变化，从而影响细胞命运决定，SIKs 与 YAP 的关联在多个物种和细胞类型中都存在，这表明 SIKs 是 YAP 的保守调节因子，在器官发生和细胞命运决定中可能发挥更广泛的作用。

SIK 的表达和活性受多种因素影响，F-actin 可能通过调节细胞内钠稳态影响 SIK 表达，此外，Ca²⁺、代谢应激等也能调节 SIK 活性。这意味着调节 bi-PPs 中的代谢变化或细胞内 Na⁺和 Ca²⁺水平，也可能通过增加 SIK 表达和 / 或活性来促进内分泌发生。

目前，基于生物反应器的 hPSCs 三维分化是规模化制备胰腺 β 细胞的理想方法，但在三维系统中直接通过操纵 ECM 控制内分泌发生存在挑战，使用肌动蛋白解聚药物也可能导致细胞形态改变甚至细胞团解体。本研究提供了不依赖 ECM 成分或肌动蛋白解聚剂的内分泌发生调节策略，NaCl 和 HG 联合处理可通过增强 SIK 活性促进内分泌发生和 β 细胞分化，有望在规模化生产中发挥作用。

综上所述，本研究揭示了胰腺内分泌分化的新分子机制，强调了 SIKs 作为 F-actin - YAP1 信号轴中介的关键作用，为促进 hPSCs 来源的 β 细胞生成提供了新的靶点，为糖尿病的细胞治疗研究开辟了新方向，也为未来相关领域的研究奠定了重要基础。未来研究可进一步深入探索 SIKs 的调控机制及其在体内的应用效果，推动基于干细胞的糖尿病治疗走向临床应用。