ELF3 在多年生植物生长停止过程中协调温度和光周期途径的关键作用

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　　# ELF3 在多年生植物生长停止过程中协调温度和光周期途径的关键作用
在寒冷的冬季，对于生活在温带和寒带地区的多年生植物来说，就像一场生存大挑战。而在这场挑战中，能否在冬天来临前及时停止生长，是决定它们生死存亡的关键。在这个过程中，短光周期（SP）和低温（LT）就像是植物的 “信号兵”，它们传递着季节变化的信息，调节着植物的生长节奏。其中，短光周期通过下调 FLOWERING LOCUS T 2（FT₂）的表达来让植物停止生长，这个过程已经被科学家们研究得比较透彻了。但低温是如何调控植物季节性生长的，却一直是个未解之谜。本文就像是一把钥匙，为我们打开了这个神秘的大门，揭示了 EARLY FLOWERING 3（ELF3）在多年生植物生长停止过程中协调温度和光周期途径的关键作用。

低温诱导杂交杨生长停止

为了搞清楚低温调控植物季节性生长停止的分子机制，科学家们首先进行了一项实验。他们把杂交杨分别放在 12°C（低温）和 20°C 的环境中培养，并且保证光照时间是有利于植物生长的长日照，这样就能排除光周期的影响。在植物感受到生长停止的信号后，会有一些明显的变化，比如不再形成新的叶子，叶原基的生长也会停滞，最后叶原基会被包裹在顶芽里。所以，从植物感受到信号到形成顶芽这段时间内长出的叶子数量，就成了判断植物生长停止反应的一个敏感指标。实验结果显示，在 12°C 环境下生长的杂交杨更早停止生长，到形成顶芽时，长出的叶子数量明显比 20°C 环境下的少，这清楚地表明，低温自己就能让杂交杨停止生长并形成顶芽。

低温靶向调控茎尖生长停止相关基因的表达

既然知道了低温能诱导生长停止，那它的作用靶点是什么呢？FT₂和赤霉素（GA）途径是短光周期调控植物生长停止的主要靶点。短光周期会下调 FT₂和 GA 生物合成关键酶基因 GIBBERELLIN 20 OXIDASE（GA20ox）的表达，同时上调 GA 降解关键酶基因 GIBBERELLIN 2 OXIDASE（GA2ox）的表达。但科学家们发现，低温处理和短光周期不一样，它并不会下调野生型杂交杨叶中 FT₂B 和 GA20ox 的表达，也不会上调 GA2ox 的表达。

这就很奇怪了，低温的靶点到底在哪呢？科学家们大胆猜测，低温可能会作用于茎尖中那些调控生长停止的基因，比如 BRANCHED 1（BRC1）以及转录因子 LAP1 和 AIL1（它们分别与拟南芥中的 APETALA1 和 AINTEGUMENTA 基因同源）。研究发现，低温确实会下调茎尖中 LAP1 和 AIL1 的表达，同时上调 BRC1 的表达。而且，与未受低温处理的植物相比，经过 8 周低温处理的植物茎尖中 GA2ox8 的表达增加了 10 倍。另外，植物激素脱落酸（ABA）在植物对低温的反应中起着重要作用，编码 ABA 生物合成限速酶的 NINE - CIS - EPOXYCAROTENOID DIOXYGENASE 3（NCED3）基因，在低温处理的植物茎尖中的表达也显著上调。

为了进一步验证这些基因和激素途径在低温介导的生长停止中的作用，科学家们采用了遗传学方法。他们发现，LAP1 表达降低的杂交杨（LAP1 - RNAi）对低温的反应比野生型更快，更早停止生长，形成顶芽前长出的叶子更少；而 LAP1 表达增强的 LAP1ox 植物则对低温不敏感，在 12°C 下也不会停止生长。AIL1 作为 LAP1 的下游靶点，也受到低温的下调。为了研究 AIL1 的作用，科学家们把 AIL1 和 SRDX（一种合成的显性抑制结构域）融合并在杂交杨中表达，结果发现 AIL1 - SRDX 植物对低温反应更快，更早停止生长。与之相反，BRC1 表达高的转基因植物对低温反应强烈，更早停止生长。

在激素途径方面，ABA 也参与其中。过表达 ABA 受体 REGULATORY COMPONENTS OF ABA RECEPTOR（RCAR1oe）的植物在低温下更早停止生长，而 RCAR 表达下调（RCAR - RNAi）的植物停止生长的时间更晚。用 GA 生物合成抑制剂多效唑（PAC）处理植物茎尖，也能让植物更早停止生长。这些结果都表明，低温通过靶向 LAP1 - AIL1 - BRC1 模块和激素途径来诱导植物生长停止。

含有 PrLD 结构域的 ELF3 蛋白是低温介导生长停止所必需的

前面的实验表明，低温会改变一些对生长停止至关重要的基因的表达，但它并没有下调 FT₂，这说明可能有其他成分在介导生长停止途径对低温的反应。之前有研究发现，含有朊病毒样结构域（PrLD）的蛋白，比如 ELF3，在拟南芥的下胚轴伸长反应和开花过程中能感知温度变化，而且 ELF3 还会发生可逆的由 PrLD 介导的从活性分散相到非活性凝聚相的转变。

科学家们在杂交杨基因组中寻找 ELF3 - 样基因，发现杂交杨只有一种 ELF3 - 样蛋白，没有 EEC（ESSENCE OF ELF3 CONSENSUS） - 样蛋白。通过预测工具分析，发现杂交杨 ELF3 含有潜在的 PrLD 结构域，虽然比拟南芥的弱一些。为了看看杂交杨 ELF3 是否会发生温度响应的相转变，科学家们把带有 C 端黄色荧光蛋白（YFP）的杂交杨 ELF3 蛋白在本氏烟草叶片中瞬时表达。结果发现，在 12°C 下，形成的核凝聚物比例比室温下低，而且低温下分散的 ELF3 - YFP 强度更高，这表明杂交杨 ELF3 会发生低温响应的相分离。

为了研究 ELF3 在低温诱导杂交杨生长停止中的作用，科学家们利用 CRISPR - Cas9 技术构建了两个 ELF3 功能缺失突变体（elf3 - 9 和 elf3 - 16）。结果发现，这两个突变体对低温都不敏感，不会停止生长和形成顶芽，到低温处理结束时，它们比野生型平均多长出 10 片叶子。这充分说明，ELF3 对低温诱导的生长停止至关重要。而且，ELF3 的转录水平在 8 周的低温处理后并没有变化，这表明它的作用不是通过转录水平调控的。

ELF3 介导低温对生长停止调节因子的响应

既然 ELF3 是低温反应的关键调节因子，那它在介导低温对 LAP1 - AIL1 - BRC1 模块和激素途径的调控中起到什么作用呢？科学家们对比了低温处理下 elf3 突变体和野生型中这些生长调节因子的表达情况。结果发现，在 elf3 突变体茎尖中，低温介导的 GA2ox8、NCED3 和 BRC1 的诱导表达严重降低，AIL1 的抑制作用也减弱了。但有趣的是，LAP1 在野生型和 elf3 突变体中都受到低温的抑制，这说明低温诱导的 LAP1 下调与 ELF3 无关。这一系列结果表明，除了 LAP1，ELF3 在关键生长停止调节因子对低温的响应中起介导作用。

降低 GA 水平可挽救 elf3 突变体的生长停止缺陷

GA 的下调在植物生长停止中起着关键作用，低温会显著上调 GA2ox8 的表达，它编码的酶对 GA 的失活很重要。但在 elf3 突变体中，低温诱导的 GA2ox8 表达严重降低。为了看看 GA 途径的失调是不是导致 elf3 突变体在低温诱导生长停止中出现缺陷的原因，科学家们用 PAC 处理野生型和 elf3 突变体植物，同时用 DMSO 作为对照。结果发现，PAC 处理的野生型植物比对照更早停止生长，长出的叶子更少。而 mock 处理的 elf3 突变体对低温不敏感，不会停止生长，但 PAC 处理的 elf3 突变体虽然反应比野生型延迟，但也能停止生长。结合基因表达研究结果，这强烈表明 GA 生物合成途径是低温诱导生长停止过程中 ELF3 下游的一个靶点。

ELF3 介导光周期对生长的调控

在自然界中，低温和光周期缩短都对控制植物生长停止的时间很关键。ELF3 是夜晚复合体（EC）的一部分，除了感知温度，它还能控制光周期反应，比如开花时间。开花和光周期调控生长停止在调节机制上有相似之处，所以科学家们猜测 ELF3 可能在短光周期诱导的生长停止中也起作用。

实验发现，ELF3 在杂交杨叶中强烈表达，而且在短光周期处理 4 周后，表达量增加了 5 倍。把植物从长光周期转移到短光周期后，野生型植物在 6 周内停止生长并形成顶芽，而 elf3 突变体却没有停止生长的迹象，长出的叶子数量是野生型的两倍，也不会形成顶芽。这说明 ELF3 是短光周期诱导杂交杨生长停止所必需的。

ELF3 是 FT₂下调所必需的

短光周期诱导生长停止是通过抑制叶片中 FT₂的表达来实现的。杂交杨有两个 FT₂拷贝（FT₂a 和 FT₂b），功能部分冗余。在野生型植物中，转移到短光周期 4 周内，叶片中 FT₂A 和 FT₂B 的表达被抑制了 100 倍，但 elf3 突变体中 FT₂的表达没有被抑制到野生型水平，在短光周期下仍然显著高于野生型。这表明 ELF3 负调控 FT₂的表达，是短光周期下调 FT₂所必需的，而 FT₂下调是诱导生长停止的关键早期步骤。

为了进一步验证 ELF3 和 FT₂之间的遗传联系，科学家们在 elf3 突变体背景下用 CRISPR 技术阻断 FT₂a 和 b 的表达。结果发现，elf3/ft₂突变体表现出严重的矮化表型，甚至在组织培养瓶中就长出了顶芽，这和 ft₂突变体的表现一样。这进一步证明了 ELF3 对短光周期介导的 FT₂抑制以及诱导生长停止是必不可少的。

讨论

准确把握生长停止的时间，对于像杨树这样的多年生植物在温带和寒带生态系统中的生存至关重要。光周期作为调节生长停止的关键信号，其相关研究已经很深入了，但野外研究发现，即使某一基因型植物生长停止的诱导光周期每年都不变，其生长停止的时间却存在显著的年际变化。这说明除了光周期，还有其他因素影响生长停止，而温度就是其中一个重要因素。在一些蔷薇科树木，比如苹果中，低温是调节生长停止的主要信号。但一直以来，低温影响生长停止的信号机制却鲜为人知，本文的研究填补了这一空白。

低温响应与光周期途径不同且靶向茎尖生长调节因子

光周期调节生长停止的信号是在叶片中被感知的，短光周期通过抑制叶片中可移动的 FT₂的转录，系统性地调节茎尖的生长停止，导致茎尖中 FT₂的下游靶点 LAP1 - AIL 途径下调，从而使植物停止生长并形成顶芽。而低温和短光周期不同，它不会下调叶片中 FT₂的表达，并且独立于 FT₂下调来抑制茎尖中 LAP1 - AIL1 的表达，同时上调茎尖中 BRC1 的表达。BRC1 能与 FT₂相互作用并在转录后抑制其功能，所以即使叶片中 FT₂没有下调，低温也能通过上调 BRC1 来抑制 AIL 的表达。这些都表明，低温通过诱导茎尖中的 BRC1 和抑制 LAP1 - AIL1 来发挥作用，虽然低温和短光周期有共同的下游靶点，但低温响应途径与光周期途径有很大不同，它不依赖于叶片中 FT₂的下调。

拮抗的 GA - ABA 途径是低温在生长停止反应中的靶点

树木的光周期生长调节与激素途径有关，尤其是对 GA 生物合成的抑制。研究发现，低温和短光周期一样，也会靶向 GA 生物合成途径来调节生长停止。基因表达分析显示，低温会诱导茎尖中 GA 分解代谢关键酶 GA2ox 的上调，用 PAC 抑制 GA 生物合成后，植物在低温下生长停止得更快，这都支持了低温负调控 GA 途径来诱导生长停止的观点。

而且，低温不仅作用于 GA 途径，还会通过上调 ABA 生物合成关键酶 NCED3 的表达来影响 ABA 途径。遗传学证据表明，下调 ABA 反应会延迟生长停止，上调 ABA 反应则会诱导早期生长停止。这说明 ABA 在低温诱导的生长停止中起作用，不过在杂交杨中，ABA 在短光周期诱导的生长停止中并没有发挥作用，这也体现了低温和短光周期介导的生长停止机制的差异。GA 和 ABA 的拮抗作用调节着植物的许多生理过程，在低温诱导生长停止中，低温通过上调 ABA 途径、下调 GA 途径来发挥作用。

类似 ELF3 的蛋白（ELF3）对低温介导的生长停止至关重要

短光周期通过下调叶片中 FT₂的表达来诱导生长停止，而低温作用于 FT₂的靶点和激素途径，且这一过程依赖于 ELF3。基因表达分析表明，ELF3 介导了像 BRC1 和 AIL1 等对生长停止至关重要的基因对低温的响应。elf3 突变体在低温下不停止生长，这充分证明了 ELF3 对低温诱导的生长停止必不可少。

ELF3 还介导低温对激素途径的调控，在 elf3 突变体中，低温诱导的 GA 失活关键酶 GA2ox 的表达显著降低。用 PAC 处理 elf3 突变体，能使其在低温下停止生长并形成顶芽。而且，ELF3 在大麦中通过调节 GA 途径来控制开花，这说明 GA 途径是 ELF3 保守的作用靶点，也体现了像 ELF3 - GA 这样的保守调控模块在响应环境信号调节植物开花和季节性生长等不同过程中的重要作用。

研究还发现，不同的 PrLD 预测工具敏感性不同，选择不同的工具和参数会得到不同的结果。但实验证明，杂交杨 ELF3 和拟南芥 ELF3 一样，会发生温度响应的相分离。在拟南芥中，ELF3 与 LUX ARRYTHMO（LUX）和 EARLY FLOWERING 4（ELF4）形成 EC 复合体，高温时 ELF3 形成凝聚物，使 EC 复合体与靶 DNA 解离，低温时 EC 复合体稳定，与 DNA 结合更紧密。杂交杨 ELF3 也有类似的相分离行为，在低温下形成的凝聚物更少，可溶性形式更丰富，这进一步证明了 ELF3 在传递温度信息调节生长停止中起核心作用。

不过，ELF3 并不调节所有参与低温介导生长停止的生长调节因子，比如 LAP1 的抑制水平在野生型和 elf3 突变体中相似，这表明可能还有其他不依赖于 ELF3 的途径参与低温介导的季节性生长调控。之前研究发现，拟南芥中的光感受器 PHYB 能感知温度，PIF7（PHYTOCHROME INTERACTING FACTOR 7）是一种 RNA 热开关，它们是否在不依赖 ELF3 的低温介导生长停止中发挥作用，还有待进一步研究。另外，拟南芥 ELF3 还有不依赖 EC 的功能，杂交杨中 ELF3 介导的生长停止是通过 EC 还是独立机制，也值得深入探究。

ELF3 是 FT₂的抑制因子

拟南芥 ELF3 是 EC 复合体的一部分，在传递光周期信号中起关键作用。杂交杨 ELF3 也在叶片中表达，而叶片是感知调节生长停止光周期信号的部位。研究发现，elf3 突变体对短光周期不敏感，这说明 ELF3 能传递光周期信号，对调节植物响应短光周期的生长停止至关重要。FT₂是光周期调控生长停止反应的主要靶点，其被短光周期下调是诱导生长停止的关键早期事件。在 elf3 突变体中，虽然短光周期处理后 FT₂的表达有所降低，但仍显著高于野生型，这可能就是 elf3 突变体不能停止生长的原因。之前在杨树中的研究发现，GIGANTEA（GI）、LATE ELONGATED HYPOCOTYL 1（LHY1）和 TIMING OF CAB EXPRESSION 1（TOC1）参与调节 FT₂的表达，LHY1 和 TOC1 是抑制因子，GI 是激活因子，而本文研究表明 ELF3 是杂交杨光周期途径中一个新发现的抑制 FT₂的<成分，在响应短光周期时抑制>₂的表达。

ELF3 整合低温和光周期响应

通过让杂交杨在低温下处于有利于生长的长光周期环境中，科学家们能够独立于光周期研究低温介导的生长停止控制，并确定相关分子成分。研究数据显示，与光周期不同，低温直接作用于茎尖的关键生长停止调节因子。有趣的是，LAP1-AIL1-BRC1 模块和 GA 途径似乎构成了一个共享的核心信号通路，共同控制植物对光周期和低温的季节性生长响应。这两种信号在自然界中共同作用来调节生长停止，它们汇聚于共同的下游靶点，这反映了它们在调节植物生长停止过程中的协同作用。虽然低温可以独立于光周期诱导生长停止，但在秋季，光周期和温度都会下降，它们共享下游靶点有助于在茎尖整合信号，使植物能够更精准地协调对这两个主要季节信号的反应，从而微调生长停止的时间，使其与季节变化同步。ELF3 在光周期和低温响应中都发挥作用，这进一步揭示了这两个主要信号是如何整合的。

重要的是，本文的研究结果解释了野外研究中观察到的生长停止时间的年际变化，这种变化无法仅用光周期作为唯一调节因素来解释。例如，虽然秋季衰老的年际变化较小，但对瑞典白杨和其他杨树的野外研究发现，生长停止时间存在显著的年际变化。本文发现光周期和低温调节生长停止途径中存在共享的核心信号成分，这有力地表明温度是导致这种年际变化的关键因素，这与之前的模型研究和其他相关研究的假设一致。

总之，实验和模型研究都表明，在自然条件下，光周期不太可能是调节生长停止的唯一因素。本文的研究确定了低温是这一过程中的另一个关键因素，并发现 ELF3 是介导低温效应的一个关键且此前未被认识的调节因子。对低温介导生长停止的分子机制的阐释，将为未来研究其他受低温显著影响季节性生长控制的经济重要树木，如苹果和梨树，提供重要的理论基础，有助于推动相关领域的遗传学研究，更好地理解和调控树木的生长发育，适应不同的环境条件，为林业生产和生态保护等提供科学依据。