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为探究尼帕病毒（NiV）RNA 合成机制，研究人员解析其聚合酶复合物结构，为抗病毒治疗提供依据。
尼帕病毒（Nipah virus，NiV），这个听起来有些陌生却又极具威胁的名字，在病毒的世界里可是一位 “狠角色”。它属于非分节段负链 RNA 病毒（non-segmented negative-strand RNA virus，nsNSV），常常引发人畜共患疾病的爆发，而且还能在人与人之间传播，就像一颗隐藏在暗处的 “定时炸弹”，随时可能对人类健康造成巨大威胁。据了解，自上世纪 90 年代在马来西亚和新加坡首次被发现以来，NiV 就时不时地 “兴风作浪”，在孟加拉国和印度等地引发疫情，其高达 80% 的死亡率更是让人谈之色变。更糟糕的是，目前针对 NiV 感染，既没有有效的疫苗，也缺乏针对性的抗病毒治疗手段，这使得它成为了世界卫生组织（WHO）重点关注的对象，被列入了流行病防范的优先名单。
在 NiV 的整个生命周期中，其 RNA 依赖的 RNA 聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）复合物起着至关重要的作用。这个复合物由 L 蛋白和 P 蛋白组成，它不仅负责病毒基因组的复制，还承担着转录的重任，就像是病毒的 “生产车间”，源源不断地制造着新的病毒。因此，它也成为了开发抗病毒药物的理想靶点。然而，尽管科学家们一直在努力探索，但关于 nsNSV 基因组复制和转录的分子机制，以及这些不同功能是如何被调控的，仍然存在许多未知。就好比我们知道了病毒的 “命门” 所在，却不知道如何准确地击中它。
为了揭开这些谜团，来自德国哥廷根大学医学中心（University Medical Center G?ttingen）、马克斯?普朗克多学科科学研究所（Max Planck Institute for Multidisciplinary Sciences）等机构的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在了《Nature Communications》上，为我们理解 NiV 的 RNA 合成机制带来了新的曙光。
在这项研究中，研究人员运用了多种先进的技术方法。其中，冷冻电镜（cryo-EM）技术发挥了关键作用，它就像是一台 “超级显微镜”，能够让研究人员在原子水平上观察蛋白质的结构。通过该技术，研究人员获得了 NiV 聚合酶复合物在 apo 状态（无核酸结合状态）和早期延伸状态（与模板 RNA、产物 RNA 和即将进入的核苷酸三磷酸（NTP）结合状态）的结构。此外，蛋白质纯化技术也不可或缺，研究人员通过一系列复杂的步骤，成功地从昆虫细胞中纯化出了高纯度的 NiV L-P 复合物，为后续的研究提供了优质的样本。
研究结果主要包括以下几个方面：
- apo NiV L-P 复合物的结构：研究人员通过共表达优化密码子的 NiV L 和 P 蛋白，并利用冷冻电镜进行分析，得到了分辨率为 2.6 ? 的 apo NiV L-P 复合物结构。该复合物由一个 NiV L 蛋白和四个 NiV P 蛋白组成，整体结构与其他 nsNSV L-P 复合物相似。其中，L 蛋白的 RdRp 和 PRNTase 结构域清晰可见，而 C 末端的 CD、MTase 和 CTD 结构域则由于构象灵活而未被观察到。P 蛋白的 OD 结构域形成了一个杆状结构，从 RdRp 核心突出，部分 P 蛋白的 XD 结构域也有密度显示。此外，RdRp 结构域具有典型的右手折叠特征，包含七个保守的结构基序，活性位点通过四个通道与外界相连。PRNTase 结构域位于 RdRp 结构域上方，其包含的一些关键元件在 apo 状态下大多呈柔性。
- 活跃延伸的 NiV L-P 复合物的结构：为了进一步了解 NiV RNA 合成的结构基础，研究人员将重组的 NiV L-P 复合物与合成的 RNA 及相关底物孵育，通过冷冻电镜分析，获得了分辨率为 2.8 ? 的 RNA 结合的 NiV L-P 复合物结构。该结构显示，与 apo 状态相比，复合物的核心结构整体相似，但一些区域的密度得到了改善，如 P 蛋白的蘑菇状尖端和部分 C 末端区域。同时，之前无序的 L 蛋白的 OD、MTase 和 CTD 结构域在 RNA 结合和合成时变得有序。在活性位点，研究人员观察到了一个 9 碱基对的 RNA 双链体，以及即将进入的 NTP（建模为 GMPPNP），表明该结构代表了早期 RNA 延伸过程中处于后转位状态且结合了即将进入底物的活跃合成复合物。
- NiV L-P 复合物与 RNA 在延伸过程中的相互作用：通过对延伸状态的 NiV L-P 复合物结构的分析，研究人员揭示了该酶在早期 RNA 合成过程中与核酸的相互作用方式。模板 RNA 通过位于 RdRp 和 PRNTase 结构域界面的模板进入通道进入活性位点，手指结构域在 RNA 结合时发生约 4 ? 的位移，可能有助于稳定进入的模板 RNA。活性位点容纳了一个 9 碱基对的 RNA 双链体，其与多个结构域的残基相互作用，包括手掌、手指、拇指和 PRNTase 结构域。即将进入的 GMPPNP 通过与模板碱基配对以及与保守残基的相互作用而稳定结合，同时，活性位点的一些关键元件在 RNA 结合时发生了重新定位以适应产物 RNA。
- NiV L-P 复合物 CD-MTase-CTD 模块的结构：冷冻电镜重建结果显示，在 apo 状态下灵活的 NiV L 的 CD、MTase 和 CTD 结构域在 RNA 结合状态下变得有序。CD 结构域具有保守的紧凑结构，通过连接子与相邻结构域相连；MTase 结构域采用特征性折叠，包含保守的基序和催化四联体，用于在转录共加帽过程中对 GTP 帽进行甲基化；CTD 结构域虽然序列保守性不强，但在结构上与其他 nsNSV 聚合酶中的 CTD 结构域同源，其 C 末端螺旋与 MTase 结构域堆叠，形成一个带正电的 RNA 结合凹槽，可能在 NiV 转录的加帽过程中发挥重要作用。
- RNA 结合和合成过程中的构象重排：对比 apo 状态和 RNA 结合状态的 NiV L-P 复合物结构，研究人员发现了一些构象重排现象。在 RNA 结合状态下，引物环和侵入环部分有序化，它们沿着 RdRp 和 PRNTase 结构域的界面延伸，介导了多个结构域之间的相互作用。同时，RdRp 结构域中的支持环和支持螺旋也发生了变化，支持环变得完全有序且构象改变，支持螺旋从 apo 状态下的灵活变得有序，这些变化与 RNA 结合和早期延伸过程中的结构重排密切相关，可能是导致柔性 C 末端结构域有序化的原因。
- NiV RNA 合成的模型：基于上述研究结果，研究人员提出了一个 NiV RNA 合成早期步骤的结构模型。首先，NiV L-P 处于 apo 状态，其 C 末端结构域、引物环、侵入环和支持环及螺旋均无序。接着，它与前导 RNA 结合形成起始复合物，之后复合物转变为早期延伸状态，此时支持环和螺旋完全有序，引物环和侵入环部分有序，导致之前移动的 C 末端结构域稳定结合。然而，RNA 进一步延伸是否会引发复合物的其他构象变化，以及复制和转录过程中的后续事件有何不同，仍有待进一步研究。
研究结论和讨论部分指出，该研究首次揭示了 NiV L-P 复合物在 apo 状态和活跃延伸状态下的结构，这不仅为我们理解 NiV 的 RNA 合成机制提供了分子层面的见解，也是首次对活跃延伸的 nsNSV L-P 复合物进行结构解析。通过对比两种状态的结构，研究人员发现了 RNA 结合和早期延伸过程中的结构重排，以及这些重排如何导致 C 末端结构域的有序化。这些结果为理解 nsNSV 的复制和转录机制提供了重要框架，也为开发针对 NiV 及相关病毒的靶向抗病毒疗法奠定了基础。尽管目前对于 NiV 的研究取得了重要进展，但仍有许多问题需要进一步探索，比如不同功能状态下 CD-MTase-CTD 模块的具体作用机制等。相信随着研究的不断深入，我们将更加了解这些病毒的奥秘，从而找到更有效的防控手段。
