3D 网状架构揭秘：CotE 蛋白如何影响芽孢形成与萌发？

本文聚焦蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）的芽孢外层蛋白 CotE，通过多种实验与分析手段，揭示其在 Ca2+和二吡啶甲酸（DPA）作用下的结构变化，阐述其 3D 网状架构对芽孢形态建成和萌发的影响，为研究芽孢生物学提供关键依据。

　　

引言

在微生物的奇妙世界里，芽孢是某些革兰氏阳性细菌应对恶劣环境的 “秘密武器”。像芽孢杆菌属（Bacillus）和梭菌属（Clostridium）的细菌，在面临营养匮乏、氧气波动等极端情况时，就会形成芽孢。芽孢就如同一个坚不可摧的 “小堡垒”，能在高温、高压、干燥等恶劣环境中存活下来，一旦环境适宜，又能迅速 “苏醒”，恢复生长。

蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）是一种常见的革兰氏阳性需氧菌，广泛存在于土壤、食物和水中。它形成的芽孢具有多层结构，其中芽孢外层的蛋白起着至关重要的作用。CotE 蛋白作为芽孢外层的关键形态发生蛋白，其结构和功能一直备受关注。虽然之前有一些关于 CotE 蛋白结构的研究，但分辨率较低，很多奥秘尚未揭开。

二吡啶甲酸（DPA）在芽孢中也扮演着重要角色。它不仅能与钙离子（Ca²⁺）结合，形成稳定的复合物，增强芽孢核心区域的稳定性，还在芽孢萌发过程中充当信号分子，触发一系列反应。本研究旨在深入探究 Ca²⁺和 DPA 对 CotE 蛋白的影响，揭示 CotE 蛋白的三维（3D）网状架构及其在芽孢形成和萌发中的作用机制。

结果

1. Ca²⁺和 DPA 改变 CotE 蛋白的寡聚状态：在纯化 CotE 蛋白的过程中，研究人员发现 Ca²⁺能诱导其聚集，而 DPA 作为一种 Ca²⁺螯合剂，可使聚集的蛋白重新溶解。通过动态光散射（DLS）和尺寸排阻色谱（SEC）分析发现，随着 Ca²⁺浓度的增加，CotE 蛋白的流体力学半径增大，寡聚化程度提高。这表明 Ca²⁺在 CotE 蛋白的寡聚化过程中起着关键作用。
2. 5 mM Ca²⁺存在下 CotE 呈蜂窝状网状结构：通过负染色电子显微镜（negative-stain EM）观察不同 Ca²⁺浓度下的 CotE 蛋白，发现在无 Ca²⁺时，CotE 分子呈小颗粒状，没有明显的聚集特征。当 Ca²⁺浓度达到 5 mM 时，蛋白形成广泛的蜂窝状网络结构，这种结构与之前观察到的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CotE 蛋白的结构相似。而当 Ca²⁺浓度升高到 20 mM 时，只观察到较大的无规则聚集物。这说明 5 mM Ca²⁺是诱导 CotE 蛋白形成特定网状结构的关键浓度。
3. Ca-CotE 网状结构的冷冻电镜（cryo-EM）结构：为了进一步揭示 Ca-CotE 蛋白在溶液中的结构特征，研究人员进行了冷冻电镜分析。结果显示，Ca-CotE 形成了多边形网状图案。通过二维（2D）分类分析，确定了其中心区域的两种主要连接方式，并得到了两种三维（3D）模型：一种是呈辐射状 Y 形的三聚体单元（C3 对称模型，分辨率为 6.55 ?），另一种是两个 Y 形三聚体的连接组装（C2 对称模型，分辨率为 6.86 ?）。这两种模型代表了 CotE 网状结构的不同部分，表明 Ca²⁺诱导的 CotE 寡聚化是由特定的分子相互作用驱动的。
4. AlphaFold2 预测的 CotE 结构相匹配：由于冷冻电镜图的分辨率有限，无法在原子水平上阐明 CotE 蛋白的结构，研究人员借助 AlphaFold2 预测模型进行分析。AlphaFold2 预测的 CotE 单体主要由 N 端结构域和无结构的 C 端尾巴组成，并且准确预测了 Y 形三聚体结构。通过将预测模型与冷冻电镜图进行叠加，发现二者匹配良好，进一步验证了模型的准确性。同时，预测模型还揭示了保守的色氨酸残基（Trp39 和 Trp65）在 CotE 蛋白相互作用中的重要作用。
5. Trp65 对 CotE 三聚体单元连接至关重要：基于 AlphaFold2 预测模型和冷冻电镜图，研究人员推测 Trp 介导的结合界面在 CotE 三聚体间的相互作用中起重要作用，其中 Trp65 可能处于核心地位。为了验证这一推测，他们构建了 W65E 突变体，将 Trp65 替换为谷氨酸，破坏了 Trp 介导的相互作用。实验结果显示，W65E 突变体的分子量明显小于野生型，且在热稳定性方面与野生型相似，这表明 CotE 本身形成稳定的三聚体单元，而 Trp65 在 CotE 的寡聚化和分子网状组装中起着关键作用。
6. 构建类金刚石构型的 CotE 网状 3D 模型：结合冷冻电镜模型中两个三聚体之间 60° 的扭转角以及 Trp65 介导的相互作用，研究人员构建了 CotE 网状结构的 3D 模型。在这个模型中，三聚体单元通过围绕连接轴 60° 的旋转相互连接，形成了一个高度约为 10 nm 的 3D 网状结构。这种结构与金刚石的四面体几何形状存在一定的相似性，但 CotE 三聚体只有三个 “臂”，因此被描述为一种缺陷类金刚石排列，这种结构可能赋予 CotE 网状结构一定的灵活性。
7. CotE 3D 网状结构的冷冻电镜断层扫描（cryo-ET）结构：为了更精确地定义 CotE 网状结构的 3D 结构，研究人员进行了冷冻电镜断层扫描分析。结果显示，CotE 的整体网状结构呈扁平状，嵌入冰层中，厚度约为 40 nm，与芽孢外层的厚度相匹配。通过对不同 Z 轴截面的分析发现，六边形晶格在 2D XY 平面和 Z 轴上都具有 10 nm 的周期性，这与基于冷冻电镜结构提出的 3D 模型中类金刚石的四面体几何形状相符，进一步支持了该模型的合理性。
8. Ca²⁺和 CotE C 端尾巴的作用：研究人员构建了缺失 C 端尾巴的 CotE 突变体（ΔCT-CotE），通过 DLS 和负染色电子显微镜分析发现，与全长蛋白不同，ΔCT-CotE 在无 Ca²⁺的情况下就能形成蜂窝状网状结构。这表明 C 端尾巴在 Ca²⁺依赖的网状结构形成中起关键作用，可能是通过静电作用抑制了三聚体之间的相互作用，而 Ca²⁺的结合可以中和 C 端尾巴的电荷，促进三聚体的结合。
9. DPA 或 CaDPA 依赖的 Ca-CotE 网状结构解体：通过等温滴定量热法（ITC）测定 CotE 与 Ca²⁺和 DPA 的结合亲和力，发现 DPA 与 CotE 的结合亲和力较高。当用 DPA 处理 Ca-CotE 时，其流体力学半径减小，分子尺寸变小，表明 DPA 能破坏 Ca-CotE 的网状结构。此外，CaDPA 虽然不能螯合 Ca²⁺，但也能使 Ca-CotE 变得可溶，且对其分子尺寸产生影响，这说明 DPA 和 CaDPA 都能干扰 CotE 三聚体之间的相互作用，导致网状结构解体。
10. Ca-CotE 水凝胶网状结构对蛋白质的包封：研究发现，Ca-CotE 网状结构具有水凝胶的特性，能够包封溶液中的蛋白质。以牛血清白蛋白（BSA）为模型蛋白，实验结果显示，在 Ca²⁺存在的情况下，CotE 能与 BSA 共沉淀，包封大量的 BSA。而预先形成的 Ca-CotE 聚集体与 BSA 混合时，BSA 则无法掺入。这表明 Ca-CotE 网状结构一旦形成，对 67 kDa 及以上的蛋白质具有一定的屏障作用，但其具体的渗透阈值尚未确定。

讨论

芽孢的外层包膜是其抵抗外界压力的重要屏障，而 CotE 蛋白在芽孢外层的形成中起着关键作用。本研究揭示了 CotE 蛋白的 3D 网状架构是由 Ca²⁺诱导形成的，且与 C 端尾巴密切相关。通过冷冻电镜、冷冻电镜断层扫描和 AlphaFold2 预测等多种技术，确定了 CotE 蛋白通过独特的缺陷类金刚石连接形成水凝胶架构，Trp65 在这一过程中发挥着不可或缺的作用。

虽然 Mn²⁺和 Ni²⁺在 5 mM 浓度下也能诱导 CotE 形成 3D 网状结构，但在生理条件下，它们的浓度很难达到这一水平，因此 Ca²⁺被认为是生理相关的诱导因素。土壤中含有 1 - 10 mM 的 Ca²⁺，且芽孢杆菌细胞中的 P 型 Ca²⁺转运蛋白 yloB 在芽孢形成前就已表达，这表明 Ca²⁺有可能在芽孢形成过程中积累到足以诱导 CotE 形成网状结构的浓度。

在芽孢形成过程中，可溶性的 CotE 三聚体通过与 SpoVID 的相互作用定位到芽孢内层之外，随着 Ca²⁺浓度的升高，CotE 通过三聚体之间的二聚相互作用形成 3D 网状结构，进而包裹其他蛋白，形成致密的芽孢外层。而在芽孢萌发时，从芽孢核心释放的 DPA 与 CotE 结合，破坏了 CotE 的网状结构，导致芽孢外层迅速解体，使芽孢能够恢复生长。

本研究通过综合运用多种实验和计算方法，深入探究了 CotE 蛋白的分子结构和功能，为理解芽孢的形成和萌发机制提供了重要的理论基础，也为开发新的抗菌策略提供了潜在的靶点，有助于解决食品和医疗行业中芽孢污染带来的问题。