嵌合抗原受体 “私人定制”，激活 NK 细胞抗癌新力量

为改善 CAR-NK 细胞疗法，研究人员优化 CAR 结构，发现 NK-CAR12 可增强抗癌活性，意义重大。

　　在癌症治疗的战场上，免疫疗法就像一把神奇的钥匙，试图打开攻克癌症的大门。嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptor，CAR）技术便是其中的 “明星选手”。CAR 是一种合成受体，能重新编程免疫细胞，让它们精准地识别并攻击癌细胞。基于 CAR 的 T 细胞疗法（CAR-T）在治疗某些癌症方面取得了显著成效，然而它也面临着诸多挑战。比如，CAR-T 细胞相关的毒性反应，像细胞因子释放综合征和神经毒性，会给患者带来额外的痛苦；而且它难以实现 “现货型” 治疗，需要为每个患者单独制备，成本高且耗时长，还容易因患者临床状况导致制备失败；此外，癌细胞还可能通过下调靶抗原逃脱 CAR-T 细胞的攻击。

为了突破这些困境，科学家们将目光投向了自然杀伤细胞（Natural killer cell，NK 细胞）。NK 细胞是人体免疫系统的重要成员，在癌症免疫监视中发挥着关键作用，能以抗原非依赖的方式清除癌细胞和癌症干细胞，而且不存在移植物抗宿主病（Graft-versus-host disease，GvHD）的风险，非常适合开发 “现货型” 癌症免疫疗法。但是，目前用于改造 NK 细胞的 CAR 主要是为 T 细胞设计的，没有针对 NK 细胞的激活信号进行优化。因此，如何优化 CAR 结构，让 NK 细胞更好地发挥抗癌作用，成为了亟待解决的问题。

来自韩国蔚山大学医学院的研究人员勇挑重担，开展了一项极具意义的研究。他们通过逐步修改 CAR 的组成部分，包括铰链（Hinge，H）、跨膜（Transmembrane，TM）和信号结构域等，构建出适合 NK 细胞的 CAR，并深入研究其功能。研究结果令人振奋，他们发现由 NK 受体 NKG2D 和 2B4 协同组合驱动的 NK-CAR，能在 NK 细胞中诱导更强的激活作用。经过一系列筛选和优化，他们确定了一种包含 DAP10、2B4 和 CD3ζ 信号结构域，以及 CD8α H 和 CD28 TM 结构域的 NK-CAR（NK-CAR12），这种 NK-CAR 在体外和体内实验中，都展现出比传统 T-CAR 更强的抗癌活性。该研究成果发表在《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》上，为癌症免疫治疗开辟了新的道路。

研究人员在研究过程中运用了多种关键技术方法。首先是基因编辑技术，利用 CRISPR-Cas9 系统构建了 CD19 基因敲除的 REH 细胞，用于评估 CAR-NK 细胞的靶向特异性。其次，通过病毒转导技术将 CAR 基因导入 NK 细胞系（NKL 和 NK92）和原代人 NK 细胞中，制备出 CAR-NK 细胞。此外，运用了多种细胞功能检测技术，如流式细胞术检测 CAR 的表达和细胞表面标志物，细胞裂解实验评估 CAR-NK 细胞的细胞毒性，免疫印迹分析检测信号通路相关蛋白的磷酸化水平等。

下面让我们详细了解一下研究的主要结果：

1. 构建诱导 NK 细胞协同激活的 NK-CARs：研究人员构建了多种 NK-CARs，测试不同的 TM 和信号结构域组合，发现携带 DAP10 接头和 2B4 细胞质信号结构域（CYP）的 NK-CAR1 诱导的细胞毒性最强，表明 DAP10 在与 2B4 CYP 结合诱导 CAR 介导的细胞毒性方面，比其他结构域更有效12。
2. 优化 NKG2D 介导的细胞毒性：研究人员对 CAR 结构进行优化，发现用 CD28 H 结构域替换 NK-CAR1 中的 CD8α H 结构域（得到 NK-CAR6），可提高细胞毒性；而用 CD28 或 NKG2D H 结构域替换 NK-CAR2 中的 CD8α H 结构域，会消除 CAR 的表面表达和细胞毒性。这表明 DAP10 接头比 NKG2D TM 结构域更适合用于进一步的 CAR 工程34。
3. 基于 DAP10 和 2B4 构建并优化 NK 定制的 CAR：研究人员构建了不同 H 和 TM 结构域的 NK-CARs，发现用 CD28 TM 替换 DAP10 EC 和 TM，可提高 CAR 的表面表达水平，其中 NK-CAR10（含 CD8α H 和 CD28 TM）的效果最佳。此外，DAP10 - 2B4 CYP 结构域的顺序比 2B4 - DAP10 更有利于产生 CAR 介导的细胞毒性56。
4. 通过整合 CD3ζ 信号结构域增强 CAR 介导的激活：在 NK-CAR6 和 NK-CAR10 的 DAP10 - 2B4 CYP 结构域基础上添加 CD3ζ CYP 结构域（得到 NK-CAR11 和 NK-CAR12），显著增强了 CAR 介导的细胞毒性，使其超过了传统 T-CAR3。而且，NK-CAR12 能更有效地杀死低 CD19 表达的肿瘤细胞78。
5. NK-CAR12 的强大细胞毒性：在 NK92 细胞和原代人 NK 细胞中，NK-CAR12 均表现出比 NK-CAR11 和 T-CAR3 更高的 CAR 表达水平和更强的细胞毒性。体内实验也证实，NK-CAR12 能显著抑制肿瘤生长，且对正常组织的毒性较低910。

在讨论部分，研究人员指出，他们的研究强调了合理组合和排列信号结构域对改善 CAR-NK 细胞信号传导的重要性。同时，H 和 TM 结构域对 CAR 的表达和功能也有显著影响，优化这些结构域对于设计 NK 定制的 CAR 至关重要。此外，虽然该研究主要关注 NK 特异性受体协同作用，但其他共刺激分子如 DAP12 和 4-1BB 对 CAR-NK 细胞的贡献也值得进一步研究。未来，通过在 CAR-NK 细胞中引入细胞因子（如 IL-15）等分子，有望增强其体内持久性和激活能力，进一步提高临床疗效。

总的来说，这项研究成功地证明了互补的 NK 特异性激活结构域在创建 NK 定制 CAR、提高 NK 细胞抗癌活性方面的有效性。研究结果为优化 NK-CAR 的合理设计提供了重要依据，通过对 H、TM 和信号结构域的组合和顺序进行优化，有望不断改进 CAR-NK 细胞疗法。同时，研究中发现的 ITAM 非依赖性信号结构域（如 DAP10 和 2B4 CYP 结构域）与传统 ITAM 依赖性 CD3ζ 信号结构域的协同作用，为增强 CAR-NK 细胞功能提供了新的思路。随着 CAR 设计的不断进步，未来有望引入更多分子有效载荷，进一步拓展 CAR-NK 细胞疗法的治疗益处，为癌症患者带来更多希望。