冻干粪便微生物群产品的体外验证：聚焦细菌活力与临床应用前景

研究人员为解决 FMT 产品的局限，开展冻干粪便微生物群（LFM）产品研究，发现 LFM 可替代冻鲜产品，提升存储与患者接受度。

　　

粪便微生物群移植的现状与挑战

在医疗领域，艰难梭菌（Clostridioides difficile，C. diff）引发的感染是个令人头疼的问题，它是医疗相关感染性腹泻的常见病因。尽管大多数初次感染能用非达霉素或万古霉素治疗，但仍有 15 - 20% 的患者会复发，给临床治疗带来巨大挑战。

粪便微生物群移植（Fecal microbiota transplantation，FMT）为这些患者带来了希望。它是将健康供体的肠道微生物群转移到患者肠道内，以恢复生理微生物群的多样性和功能，对复发性艰难梭菌感染（rCDI）的治疗效果显著，有效率高达 90%，因此被许多指南推荐用于预防 rCDI 的再次发作。不仅如此，FMT 在代谢、恶性、自身免疫和神经精神疾病等领域的治疗潜力也在临床试验中被探索。

然而，FMT 的应用并非一帆风顺。传统的 FMT 通常采用新鲜或冷冻的粪便悬浮液，通过结肠镜、鼻空肠管或口服胶囊等方式给药。但新鲜产品保存时间短，冷冻产品虽便于物流，却存在存储、稳定性和运输依赖昂贵基础设施的问题，且两者在患者接受度方面也有待提高。

研究机构与研究目的

为了解决这些问题，来自德国歌德大学法兰克福分校附属医院、埃及阿斯尤特大学等多个机构的研究人员，开展了一项关于冻干粪便微生物群（Lyophilized fecal microbiota，LFM）产品的研究。他们旨在评估冻干过程对细菌活力和代谢物水平的影响，并开发适用于德国临床使用的 LFM 胶囊。

研究方法

研究人员从科隆微生物群库（CMB）筛选出 8 名健康供体，每位供体提供一份至少 120g 的粪便样本，并在捐赠后半小时内按照药品生产质量管理规范（GMP）进行处理。

研究采用了多种技术方法：使用 QUANTOM Tx^TM微生物细胞计数器和细菌培养法（针对需氧菌、厌氧菌和孢子）分析微生物活力；通过细菌 16S rRNA 基因扩增子测序和胆汁酸分析，进一步明确 LFM 产品成分的潜在变化；利用体积卡尔费休滴定法测定残留水分含量。

研究结果

1. 细菌细胞计数：新鲜未处理粪便中的总细菌细胞浓度为 5.02×10¹¹ cells/g，新鲜制备的悬浮液中为 8.23×10¹⁰ cells/g，冻干样品复溶后第 3 天的总细胞浓度均值为 8.05×10¹⁰ cells/g，各后续样本的细胞浓度无显著差异。新鲜未处理粪便中活细菌细胞浓度为 3.5×10¹¹ cells/g，新鲜制备悬浮液中为 6.07×10¹⁰ cells/g，冻干样品复溶后第 3 天的活细菌细胞浓度均值为 4.62×10¹⁰ cells/g，所有后续样本的活细胞计数也无显著差异。
2. 细菌培养：对粪便样本进行厌氧菌、需氧菌和孢子培养，结果显示，第 3 天和第 30 天的冻干粪便悬浮液与冷冻悬浮液之间，无统计学显著差异。
3. 胆汁酸分析：不同 FM 制剂的总胆汁酸浓度存在显著差异。未处理粪便中的总胆汁酸浓度显著高于冻干样品和添加甘油的处理后粪便悬浮液。初级和次级胆汁酸在不同制剂中的浓度也有显著差异，未处理粪便中的含量高于冻干样品。
4. 16S rRNA 基因扩增子测序：冷冻和冻干处理对供体样品的 α 多样性无影响，且样品的分类组成不受储存时间的影响。样本的差异主要源于不同的供体，而非制备方法或储存时间。
5. LFM 胶囊制备：标准粪便捐赠（50g）平均可获得 2.48g ± 0.38g 冻干粉末，手动填充到 0 号延迟释放羟丙甲纤维素胶囊中，每个胶囊装 0.2g 粉末。一份捐赠可制成 12.4 ± 2 个胶囊（10.5 - 14 个），每个胶囊约含 1.86×10¹¹个活细菌细胞和 3.24×10¹¹个总细菌细胞。
6. 残留水分测量：一次干燥后的残留水分含量几乎是二次干燥后的两倍，二次干燥后的水分含量在很窄的范围内，且与一次干燥后的测量值相比，偏离中位数的程度较小。

研究结论与讨论

这项研究为冻干 GMP 生产的 FM 胶囊提供了全面的体外验证概念，重点关注了细菌活力。研究表明，在 4°C 下储存（含 5% 海藻糖）的 LFM，其细菌活力和胆汁酸组成与新鲜处理的粪便悬浮液或含 10% 甘油的冷冻 FM 相比，保持稳定且无显著损失。

研究发现，虽然过滤和离心等处理步骤可能导致细菌数量下降，但临床中使用这种处理方式的粪便成功治疗 rCDI 的案例众多，其临床相关性仍需进一步研究。对于冻干过程中的二次干燥，虽未发现其对细菌活力有负面影响，但仍存在一些可能影响结果的因素，如细胞计数器的解聚问题、样品制备不当或冻干样品重悬不充分等。

在胆汁酸方面，研究结果与之前的研究有所不同，推测可能是本研究中粪便处理步骤导致冻干样品中胆汁酸浓度下降，这一假设需要后续研究验证。此外，研究还存在一些局限性，如供体样本量小、培养需氧菌和厌氧菌的时间有限、活力研究最长仅 3 个月且未评估 LFM 胶囊的活力等。未来需要更大样本量和更长随访期的研究来解决这些问题。

总体而言，该研究为 LFM 产品在临床应用中的可行性提供了重要依据，有望通过减少胶囊数量、降低异味、简化存储和运输以及降低成本等方式，使更多患者受益于 FMT 治疗。论文发表在《World Journal of Microbiology and Biotechnology》，为该领域的研究和实践开辟了新的方向。