金黄色葡萄球菌光动力灭活定量 PCR 研究中内参基因的评估：关键发现与意义

为准确分析金黄色葡萄球菌（S. aureus）光动力灭活（PDI）实验基因表达数据，研究人员评估内参基因，确定了稳定内参基因，为相关研究提供依据。

　　在医学研究的微观世界里，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，简称 S. aureus）可是个 “大麻烦”。它是引发严重医院感染的重要病原菌，不仅能迅速产生耐药性，还会释放多种致病因子，导致各种高死亡率的感染。在实验室中，研究人员常利用光动力灭活（Photodynamic inactivation，PDI）实验来探索新的抗菌疗法，PDI 是通过光敏剂吸收可见光产生活性氧，破坏细菌的核酸、蛋白质和脂质，从而杀死细菌。而在 PDI 实验中，定量实时聚合酶链反应（Quantitative real-time PCR，qPCR）是常用的检测基因表达的技术，但 qPCR 数据需要稳定的内参基因进行标准化处理，才能保证结果准确可靠。然而，目前针对金黄色葡萄球菌在 PDI 实验中的内参基因稳定性研究较少，且不同实验条件下内参基因的稳定性差异很大，这就像在黑暗中摸索，给研究人员带来了极大的困扰。

为了解开这些谜团，斯洛伐克的 Comenius University in Bratislava 的微生物学和病毒学系以及 Slovak Academy of Sciences 的动物学研究所的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Heliyon》杂志上。

研究人员用到的主要关键技术方法有：首先，培养了标准菌株金黄色葡萄球菌 CCM 3953 和耐甲氧西林菌株 L18，分别制备浮游细胞、24 小时生物被膜以及聚氨酯（PU）纳米材料上的 24 小时生物被膜；接着，对这些样本进行 PDI 处理；之后，提取 RNA 并反转录为互补 DNA（cDNA）；最后，进行实时 qPCR 实验，并利用四种算法（geNorm、NormFinder、BestKeeper 和 ΔCq）分析数据 。

研究结果如下：

1. 基因扩增效率和 Cq 值：除 rrsC 基因外，大多数测试基因的 PCR 扩增效率在 90 - 110% 的可接受范围内。rrsC 基因的扩增效率为 79.1%，与之前研究有所不同，说明相同引物在不同实验条件下效率可能不同。大多数基因在浮游细胞和生物被膜样本中的 Cq 值相似，约为 20，但在生物被膜 - PU 样本中，Cq 值更高，约为 25。rrsC 基因在所有样本中表达量高，Cq 值低，在浮游细胞和生物被膜样本中约为 12，在生物被膜 - PU 样本中约为 14。
2. 基因表达稳定性分析：
   • geNorm 分析：rho 和 rpoD 在大多数样本中是最稳定的基因对，在 L18 浮游细胞和 CCM 生物被膜中，femA 和 rpoD、rho 和 glyA 的组合也达到了最稳定的 M 值。
   • NormFinder 分析：结果与 geNorm 相似，最稳定的基因大多匹配，但在 CCM 浮游细胞和生物被膜 - PU 样本中，排名有所不同。rrsC 在两种分析中始终是最不稳定的基因。
   • BestKeeper 分析：在浮游细胞 CCM 和 L18 样本中，glyA 和 hu 分别是最稳定的基因；在生物被膜 CCM 和 L18 样本中，rpoD 是最稳定的基因。但 BestKeeper 与其他分析方法的基因排名存在差异。
   • ΔCq 分析：在浮游细胞样本中，CCM 的 glyA 和 L18 的 rpoD 是最稳定的基因；在生物被膜样本中，CCM 的 rho 和 L18 的 glyA 最稳定；在生物被膜 - PU 样本中，CCM 的 glyA 和 L18 的 femA 最稳定。
   
   
3. 综合分析：综合所有分析，在浮游细胞中，最稳定的基因是 rho 和 rpoD，或者 rpoD 和 femA；在生物被膜中，是 rho 和 glyA；在 CCM 生物被膜 - PU 样本中，是 rpoD 和 glyA；在 L18 生物被膜 - PU 样本中，是 femA 和 rpoD。rrsC 在所有测试样本中始终是最不稳定的基因。
4. 基因表达差异分析：通过 NormFinder 分析发现，浮游细胞 CCM 和 L18 中，glyA 的组内和组间变异最小；生物被膜 CCM 和 L18 中，rho 的变异最小；生物被膜 - PU 样本中，glyA 的变异最小，且 CCM 样本的组内变异比其他样本组大。

研究结论和讨论部分表明，不同实验条件可能需要单独验证候选内参基因，以确保基因表达结果可靠。rho、rpoD 和 glyA 是金黄色葡萄球菌标准菌株和耐甲氧西林菌株在多种涉及 PhB - 耦合 PDI 和特定光活性纳米材料的实验条件下，较为合适的标准化因子。该研究为金黄色葡萄球菌 PDI 实验中的内参基因选择提供了重要参考，有助于更准确地研究基因表达变化，推动抗菌研究领域的发展，为开发新的抗菌疗法奠定了基础。