揭秘铜绿假单胞菌生物膜转换机制：eDNA 的关键作用与调控策略

研究人员针对铜绿假单胞菌生物膜转换机制展开研究，发现 eDNA 释放是关键，且可调控生物膜形成。

　　在微观的细菌世界里，细菌的生存策略一直是科学家们关注的焦点。其中，铜绿假单胞菌（Pseudomonas sp.）从浮游态转变为固着态形成生物膜的过程，就像一场神秘的 “变身”。这一转变过程受到多种因素影响，极为复杂。在过去的研究中，由于缺乏与生物膜转换相关的单细胞指标，这一转变过程并未被深入了解。目前，对于生物膜形成的调控网络仍不清晰，现有的研究大多集中在成熟生物膜或浮游态到生物膜转变过程中的基因表达差异上，难以找到可靠的单细胞指标来描述生物膜形成的初始步骤。

为了揭开这场 “变身” 的秘密，来自比利时列日大学（University of Liege）Terra 研究与教学中心、丹麦技术大学诺和诺德基金会生物可持续性中心的研究人员，以恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）KT2440 及其衍生物为研究对象展开了研究。他们的研究成果发表在《iScience》杂志上，为我们深入理解铜绿假单胞菌生物膜转换机制提供了新的视角。

在研究中，研究人员运用了多种关键技术方法。其中，自动流式细胞术（FC）是重要的技术手段之一，通过它可以对细胞进行快速、准确的分析，实现对细胞群体动态变化的监测。另外，Segregostat 培养技术的应用，使得研究人员能够根据细胞的表型转换情况进行环境调控。

下面让我们来看看具体的研究结果：

• PI 染色可有效检测 eDNA 相关细胞：研究人员发现，碘化丙啶（PI）能与细胞外 DNA（eDNA）结合产生特定信号。通过对恶臭假单胞菌 DGC（P. putida DGC）的研究，利用 PI 和 SYTO9 双染色，借助高分辨率共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察发现，存在一部分细胞呈现 “中间” 表型，其表面有 PI 标记的 eDNA 片段。FC 分析也表明，PI 阳性、与 eDNA 相关的细胞亚群在培养早期就已产生，且这些细胞具有代谢活性。此外，用 DNA 酶处理生物膜样本后，PI 阳性细胞数量显著减少，进一步证明 PI 染色确实是由于细胞与 eDNA 的结合。
• 生物膜转换在浮游早期由 eDNA 相关细胞亚群决定：研究人员通过构建具有不同生物膜形成能力的恶臭假单胞菌菌株进行实验。结果显示，eDNA 在细胞外培养基中逐渐积累，且与 PI 染色细胞的存在相关。生物膜形成能力强的 P. putida DGC 菌株，其细胞聚集现象更明显，而敲除 lapA 基因导致生物膜形成能力降低的菌株，细胞聚集现象较少。这表明生物膜形成能力与细胞自聚集能力密切相关，PI 可作为追踪浮游态细胞生物膜形成早期决策过程的分子探针。
• eDNA 结合与细胞自聚集相关：研究人员利用自动 FC 对连续培养中的细胞群体动态变化进行监测。通过对 PI 荧光、细胞大小和形态等参数的分析，发现细胞向生物膜生活方式的转变与浮游态细胞聚集体的形成有关，且 PI 信号与细胞自聚集以及后续生物膜形成之间存在密切联系。
• 生物膜形成与突发的多样化动态相关：在微生物生态中，表型转换通常伴随着一定的成本。以芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的孢子形成过程为例，其表型转换成本高，呈现突发的多样化动态。研究人员推测，恶臭假单胞菌的生物膜转换也可能存在类似情况。通过 Segregostat 培养和 PI 染色实验，发现恶臭假单胞菌在生物膜转换过程中也出现了多样化的突发情况，这些突发情况可作为生物膜转换的早期预警指标。
• 控制突发可减少生物膜形成：鉴于生物膜转换的多样化动态具有突发性，研究人员利用自动 FC 检测这些突发情况，并通过 Segregostat 培养添加葡萄糖脉冲进行干预。结果发现，这种方法能够降低细胞群体的表型异质性，减少生物膜的形成。

在研究结论和讨论部分，研究人员指出，铜绿假单胞菌的生物膜转换是细胞在浮游生长早期的集体决策，这一决策受释放到细胞外培养基中的 eDNA 量影响。PI 染色可用于检测与 eDNA 相关的细胞，且 PI 阳性 /eDNA 相关细胞的比例与群体的整体生物膜形成能力相关，这挑战了传统的表型转换观点。此外，自动 FC 和 Segregostat 培养为研究生物膜转换机制和控制生物膜形成提供了有力工具。

这项研究为我们深入理解铜绿假单胞菌生物膜转换机制提供了重要依据，也为控制生物膜形成提供了潜在策略，在微生物学和生物技术领域具有广阔的应用前景。未来，研究人员可以进一步探究不同环境条件下生物膜形成的机制，以及在多物种生物膜中验证相关结论，为相关领域的发展提供更多理论支持。