线粒体动力学在心脏直接重编程中的关键作用

推荐阅读：本文揭示线粒体融合对诱导心肌细胞（iCM）转换至关重要，Mtfr1l 是重编程的关键障碍。

　　### 线粒体动力学在心脏直接重编程中的关键作用
在生命科学和健康医学领域，心脏疾病的研究一直是重点。缺血性心脏病，如心肌梗死（MI），是全球范围内的主要死因。由于成熟哺乳动物心肌细胞（CMs）缺乏增殖能力，心肌梗死后肌肉损失往往不可逆，心脏成纤维细胞（CFs）形成的瘢痕组织功能不佳，易导致心力衰竭。将 CFs 重编程为功能性诱导心肌细胞（iCMs）为心脏损伤的治疗带来了希望，但这一过程中，线粒体的代谢和形态变化机制却一直是个谜。本文聚焦于此，深入探究了线粒体在心脏重编程中的作用，为心脏疾病的治疗开辟了新的研究方向。

线粒体与心肌细胞的关系及研究背景

线粒体在心肌细胞的能量供应中扮演着核心角色。心肌细胞高度依赖线粒体产生的能量，其线粒体通过高度互联的网络进行高效的能量代谢。在心肌细胞的发育过程中，从新生到成熟，或者从诱导多能干细胞（iPSCs）分化为心肌细胞，都伴随着从主要依赖糖酵解到主要依赖线粒体供能的代谢重编程。这种代谢转变对心肌细胞的成熟和功能维持至关重要，许多促进非心肌细胞重编程为功能性心肌细胞的因素，要么抑制促糖酵解途径，要么促进线粒体呼吸。

线粒体的能量生成与其形态密切相关。线粒体的形态由其外膜（OMMs）和内膜的融合（joining）与裂变（dividing）动态平衡决定。融合活动增加会形成更大的线粒体网络，与更高的 ATP 产生相关，而线粒体嵴（cristae）作为能量产生的主要场所，其数量和密度会随着线粒体能量代谢的增强而增加。在心肌细胞中，线粒体分为高度融合的肌原纤维内线粒体（IFMs）和外周线粒体，它们分别在促进肌肉收缩和物质运输等方面发挥独特作用。

尽管心脏重编程的研究在遗传、表观遗传和转化机制方面取得了不少进展，但线粒体或代谢因素对 iCM 生成的影响却知之甚少。与心肌细胞相比，心脏成纤维细胞的线粒体数量少、更碎片化、嵴密度低且能量活性较弱。因此，成功的心脏重编程需要在新生 iCMs 中增加线粒体的生物发生、融合和呼吸，而目前对这一过程中的代谢转变和线粒体重组机制仍不清楚。

线粒体能量学和结构在 mnCFs 和 CMs 中的定量比较

为了深入了解线粒体在心脏重编程中的变化，研究人员首先对小鼠新生儿心脏成纤维细胞（mnCFs）和心肌细胞（mnCMs）的线粒体进行了定量比较。通过线粒体应激测试（MSTs），发现 mnCMs 的基础、ATP 相关、ROS 相关（质子泄漏）和最大线粒体呼吸显著高于 mnCFs，但两者的备用呼吸能力相似，这意味着它们在应对压力或其他刺激时，增加线粒体能量产生的能力相近。

利用 MitoSinCe2²工作流程对单个活细胞的线粒体结构和功能进行量化分析发现，mnCMs 的线粒体数量更多，网络节点和边缘更多，且节点的连接更为复杂，具有更多的 4 向连接和更少的自由端。同时，mnCMs 的线粒体跨膜电位（TM-Ψ）更高，线粒体总长度和体积更大，表明其线粒体质量更高。不过，MitoSinCe2²分析也存在一定局限性，例如对 mnCMs 线粒体宽度的测量结果与电子显微镜测量结果存在冲突，可能是由于 MitoGraph 对密集排列的 CM 线粒体进行骨架化处理导致的误差。总体而言，mnCMs 的线粒体网络在丰度、互联性和能量代谢方面明显优于 mnCFs。

心脏重编程过程中线粒体能量学和形态的特征

为了描述细胞中线粒体向 CM 样或 CF 样表型的转变程度，研究人员设计了线粒体身份（ID）分数。通过选择与 CM 和 CF 相关的特定指标，计算出重编程分数，结果显示该分数能够有效区分 mnCFs 和 mnCMs。

在诱导 mnCFs 进行心脏重编程的过程中，研究人员对不同时间点的线粒体进行了分析。MST 结果表明，重编程过程中线粒体呼吸逐渐增加，在重编程第 2 周时，基础、ATP 相关和 ROS 相关的 OCRs 升高，但基础和 ATP 相关的 OCRs 始终未达到 mnCMs 的水平，而质子泄漏在第 2 周达到并超过了 mnCMs 的水平，备用容量则始终未超过对照组。

MitoSinCe2²分析显示，在重编程早期（第 7 天），线粒体含量虽无显著变化，但 CF 分数指标显著降低，部分 CM 分数指标增加，线粒体 ID 分数表明线粒体向 CM 样表型转变。随着时间推移，到第 29 天，重编程细胞的线粒体出现双峰分布，部分指标进一步向 CM 样表型转变。透射电子显微镜（TEM）结果显示，重编程 6 周时，iCMs 的线粒体平均面积增大，嵴密度增加，但未观察到线粒体明显整合到肌原纤维中。此外，重编程第 2 周时，线粒体融合和线粒体编码基因的表达增加，表明存在线粒体生物发生。这些结果表明，心脏重编程诱导了向线粒体能量代谢的转变，但这一转变相对不完全，暗示线粒体能量转换可能是转化为成熟 iCMs 的限速步骤。

线粒体融合对 iCM 转换至关重要，Mtfr1l 是主要障碍

为了探究线粒体动力学对心脏重编程的影响，研究人员进行了一系列实验。首先，通过筛选小分子抑制剂，发现抑制线粒体裂变的 p110 能增加 iCMs 的产量，而抑制线粒体融合的抑制剂则会消除重编程。这表明线粒体融合对于 iCM 转换是必不可少的。

随后，研究人员利用慢病毒短发夹 RNA（shRNA）构建体对线粒体动力学调节因子进行了功能丧失（LoF）筛选。结果发现，敲低线粒体融合相关基因如 Opa1、Mfn1 和 Mfn2 会损害 iCM 转换，而线粒体裂变调节因子 Mtfr1l 则是一个强大的重编程障碍。敲低 Mtfr1l 能显著提高 iCM 的产量，在不同类型的成纤维细胞中均有类似效果，如在 mnCFs 中 iCM 产量增加约 5 倍，在小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中增加约 3 倍，在小鼠成年 CFs（maCFs）中增加约 2 倍。同时，敲低 Mtfr1l 还能促进 iCMs 的功能成熟，表现为 CM 标记物表达增加、自发搏动区域面积增大以及钙循环细胞增多。

敲低 Mtfr1l 改变 iCMs 线粒体表型

敲低 Mtfr1l 不仅提高了 iCM 的产量，还对线粒体的结构和功能产生了显著影响。在重编程第 2 周时，MST 结果显示，敲低 Mtfr1l 的细胞基础和 ATP 相关的 OCRs 显著增加，质子泄漏也有所增加，表明线粒体能量代谢向更 CM 样的表型转变。

MitoSinCe2²分析表明，敲低 Mtfr1l 后，线粒体结构发生变化，线粒体数量减少，但总长度和体积不变，意味着线粒体质量整合到更少、更大的网络中。CF 分数指标中的裂变和自由端减少，平均边缘和平均宽度增加；CM 分数指标中的 fusion1 和 4 向连接增加，而 norm. edges 指标降低。此外，MHS 和 TM-Ψ 显著增加，反映出更高的细胞内异质性和电子传递系统（ETS）活性。

通过对线粒体与肌节整合的研究发现，敲低 Mtfr1l 的细胞中，线粒体与肌节蛋白的重叠程度发生变化，HSP60 与 cTnT 的重叠减少，而 MTDR 与 ACTN2 和 cTnT 的重叠增加。TEM 结果显示，在重编程第 2 周，敲低 Mtfr1l 的细胞线粒体及其嵴更大，但嵴密度较低；到第 6 周，平均线粒体面积差异消失，但嵴密度增加。这些结果表明，敲低 Mtfr1l 促进了 CM 样线粒体表型的形成，导致更功能成熟的 iCMs。

Mtfr1l 敲低促进细胞命运转化的机制及与 Opa1 的关系

为了探究敲低 Mtfr1l 增加 iCM 产量和改变线粒体表型的机制，研究人员进行了批量 RNA 测序（RNA-seq）。结果显示，在 mnCFs 和重编程细胞中，敲低 Mtfr1l 导致基因表达发生变化，在 mnCFs 中下调了与细胞外基质（ECM）组织和结缔组织发育相关的基因，上调了与心房 CM 通讯和 ECM 分解相关的基因；在重编程细胞中，上调了与心脏发育、钙信号和肌肉收缩相关的基因，同时进一步下调了与成纤维细胞活性相关的基因。

此外，敲低 Mtfr1l 还导致了线粒体能量代谢和生物发生相关基因的上调，以及 ECM 相关基因集的下调。同时，发现敲低 Mtfr1l 会使 Mfn1、Mfn2 以及 DRP1 招募蛋白 Mff 和 Mief2 的表达略有增加，这可能是对 Mtfr1l 缺失的一种补偿机制或增强的线粒体周转。

已知 Mtfr1l 的靶点 Opa1 在敲低实验中会消除重编程。进一步研究发现，同时敲低 Opa1 和 Mtfr1l 会减轻单独敲低 Mtfr1l 对重编程的促进作用，表明它们之间存在共享调控机制。转录组分析显示，敲低 Mtfr1l 和 Opa1 会导致不同基因簇的表达变化，这些变化与心脏发育、线粒体凋亡信号、纤维化和氧化应激等过程相关。总体而言，敲低 Mtfr1l 通过促进线粒体融合、嵴重组和线粒体能量代谢，削弱成纤维细胞特性，促进 CM 身份的获得，而 Opa1 的缺失则会抑制这一过程。

利用机器学习通过线粒体表型预测活细胞重编程

在心脏再生医学的研究和临床转化中，需要新的工具来评估活细胞中的重编程。研究人员尝试利用线粒体指标构建机器学习模型来识别重编程细胞。通过对所有 MitoGraph 和 MitoSinCe2²指标进行分析，发现 MGT 表达细胞与 mnCMs 的聚类比其匹配的 mnCFs 更紧密，MGT+shMtfr1l 细胞与 mnCMs 的一个聚类更接近。

基于这些结果，研究人员构建了一个基于 FIS、MHS 和 TM-Ψ 的模型。该模型在训练和测试数据集上表现良好，尤其是包含 TM-Ψ 的模型，其预测结果与传统评估方法的趋势相符，能够在重编程第 2 周预测重编程细胞的出现。虽然该模型还需要进一步优化，以更准确地识别单个细胞为潜在的 iCMs，但这一尝试为实时评估重编程提供了新的思路。

研究的意义、局限性与展望

本文深入研究了线粒体在心脏重编程过程中的结构 - 功能关系，发现线粒体融合对 iCM 转换至关重要，而 Mtfr1l 是心脏重编程的强大障碍。这一发现为理解心脏重编程的代谢机制提供了新的视角，也为心脏疾病的治疗提供了潜在的新靶点。

然而，该研究也存在一些局限性。例如，在量化线粒体形态和功能时，受到技术分辨率的限制，现有指标无法完全准确描述 CM 线粒体网络；SinCe2²分析的低通量导致缺乏统计能力，难以识别稀有亚群；实验未考虑性别对线粒体重排的影响；此外，虽然提出了多种潜在机制，但相关调控途径仍有待进一步探索。

未来的研究可以利用谱系追踪工具进一步细化研究结果，结合更多功能探针深入研究线粒体功能变化，同时关注性别差异对心脏重编程中线粒体变化的影响。这些研究将有助于更深入地理解心脏重编程的机制，推动心脏再生医学的发展，为心脏疾病的治疗带来新的希望。