抗病毒防御中的双刃剑：ATG7 结合 Dicer 促进病毒复制，揭示病毒感染新机制

为探究自噬与 RNA 干扰（RNAi）在控制流感病毒复制中的关系，研究发现 ATG7 结合 Dicer 抑制 RNAi，影响病毒复制，意义重大。

　　在生命的微观战场上，病毒与宿主细胞之间的攻防战时刻都在上演。RNA 干扰（RNAi）和自噬作为细胞内重要的抗病毒防线，一直是科学家们关注的焦点。RNAi 就像细胞内的 “精确制导武器”，能通过 Dicer 蛋白切割病毒双链 RNA（dsRNA）形成小干扰 RNA（vsiRNA），精准打击病毒的同源 RNA，阻断其复制。而自噬则如同细胞的 “清道夫”，负责清除受损的蛋白质和细胞器，在病毒感染时，也能吞噬病毒颗粒，维持细胞内环境的稳定。

然而，这两条重要的抗病毒防线之间的关系却一直迷雾重重。虽然已有研究表明它们都参与了病毒复制的调控，但在病毒感染过程中，它们究竟是如何相互协作或者对抗的，至今尚无定论。尤其是在流感病毒等禽 RNA 病毒感染时，宿主细胞内这两种机制的变化以及它们对病毒复制的影响，更是亟待解答的谜题。

为了揭开这层神秘的面纱，南京农业大学的研究人员展开了深入探究。他们的研究成果发表在《Cellular and Molecular Life Sciences》上，为我们理解病毒感染机制和开发新的抗病毒策略提供了重要线索。

研究人员主要采用了细胞实验、蛋白免疫印迹（Western blotting）、定量实时聚合酶链反应（qPCR）、免疫荧光分析（IFA）、共免疫沉淀（CO-IP）等技术。细胞实验使用了 DF-1 细胞、Madin-Darby 犬肾（MDCK）细胞和人胚肾（HEK-293T）细胞；样本来源于美国典型培养物保藏中心（ATCC），禽流感病毒（AIV，H9N2）、传染性法氏囊病病毒（IBDV）和传染性支气管炎病毒（IBV）由江苏省农业科学院提供。

AIV-H9N2 感染影响自噬和 RNAi 通路

研究人员首先对感染 AIV-H9N2 的 DF-1 细胞展开研究。通过免疫荧光分析和噬斑实验，他们发现随着感染复数（MOI）从 0.01 增加到 1，病毒载量上升，且 MOI 为 1 时细胞损伤严重。蛋白免疫印迹结果显示，不同 MOI 的 AIV-H9N2 感染会降低 RNAi 相关蛋白 Dicer 的水平，同时增加自噬相关蛋白的水平。进一步研究发现，随着 0.1 MOI AIV-H9N2 感染时间的延长，AIV-H9N2 的 NS1 和 HA 水平以及 LC3^II/LC3^I比值上升，而 Dicer 和 P62 水平下降。这表明 AIV-H9N2 感染导致自噬通路上调，RNAi 通路下调。

自噬和 RNAi 通路参与 AIV-H9N2 复制

为了探究自噬和 RNAi 是否影响病毒复制，研究人员构建了 Dicer 过表达和沉默质粒。实验结果表明，过表达 Dicer 蛋白可减少 AIV-H9N2 的病毒颗粒数量和蛋白水平，而沉默 Dicer 则适度增加病毒复制。同时，研究人员还测试了自噬增强剂雷帕霉素（RAPA）和自噬抑制剂氯喹（CQ）对 DF-1 细胞的影响。结果显示，RAPA 激活自噬有利于 AIV-H9N2 复制，而 CQ 抑制自噬则有效降低病毒载量。此外，研究发现 Dicer 过表达对 LC3^II/LC3^I表达水平影响不显著，且 Dicer 主要影响病毒介导的自噬通路。这些结果表明，自噬和 RNAi 均能影响 AIV-H9N2 复制。

自噬通过 ATG7 抑制 Dicer 依赖的抗病毒 RNAi 反应

RNAi 是抵御 RNA 病毒的重要机制。为探究 AIV-H9N2 感染细胞中 RNAi 抑制是否与自噬上调有关，研究人员用 RAPA 和 CQ 处理细胞后分析 Dicer 的表达。结果显示，RAPA 抑制 Dicer 表达，CQ 促进其表达，表明自噬通路激活抑制 Dicer 表达。进一步研究发现，AIV-H9N2 感染显著增加 HIF1A 和 ATG7 的表达，降低 NDP52 和 Beclin1 的表达。构建相关过表达质粒实验表明，ATG7 过表达使 Dicer 显著下降，Beclin1 过表达使 Dicer 适度增加。

ATG7 直接通过 D684 位点与 Dicer 相互作用促进 AIV-H9N2 复制

研究人员通过共免疫沉淀实验发现 ATG7 蛋白可与 Dicer 相互作用，且存在外源性和内源性相互作用。构建 ATG7 敲低质粒实验表明，ATG7 过表达显著增加病毒滴度，敲低则降低病毒载量。分子对接研究揭示了 ATG7 与 Dicer 的结合位点，构建 ATG7 位点缺失质粒实验表明，ATG7 主要通过 D684 位点与 Dicer 相互作用，该位点影响 AIV-H9N2 复制。此外，检测病毒衍生的小 RNA（vsiRNAs）发现，ATG7 过表达减少 vsiRNAs 数量，敲低则增加。

ATG7 影响 Dicer 产生小 RNA 的能力

研究人员对 ATG7 过表达和沉默组进行小 RNA 测序和京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析。结果显示，ATG7 过表达和沉默均导致微 RNA（miRNA）显著变化，且差异表达的 miRNA 参与调节自噬成分、MAPK 信号通路和代谢途径。同时，ATG7 过表达减少 AIV-H9N2 感染组的总 siRNAs 和 21 - 23 nt vsiRNAs 数量，沉默则增加，表明 ATG7 与 Dicer 结合抑制其切割功能，影响 vsiRNA 合成，进而影响 AIV-H9N2 复制。

ATG7 在其他 RNA 病毒感染时也抑制 Dicer 表达

研究人员选用 IBDV 和 IBV 进行实验，发现感染这两种病毒后，DF-1 细胞中 ATG7 蛋白表达增加，Dicer 蛋白表达降低。转染 ATG7 过表达质粒后，病毒载量显著增加，Dicer 表达显著下降。对 IBDV 感染鸡的单细胞测序数据分析也得到类似结果，且 KEGG 和 GO 分析表明 IBDV 感染影响多种细胞过程。

研究结论表明，禽 RNA 病毒感染 DF-1 细胞可导致自噬相关基因高表达、RNAi 低表达，ATG7 蛋白与 Dicer 蛋白相互作用影响 Dicer 切割病毒 dsRNA 的能力，使宿主细胞对病毒复制的抵抗力下降。该研究首次揭示了 ATG7 蛋白在调节自噬和 Dicer 酶方面的关键作用，显著影响禽类 RNA 病毒的复制水平。这一发现为理解病毒复制机制提供了新视角，也为开发针对多种 RNA 病毒的抗病毒策略提供了潜在靶点。未来，有望通过开发小分子抑制剂或利用肽 / 抗体阻断关键相互作用位点等方式，调节 ATG7-Dicer 相互作用，增强抗病毒防御能力，减轻病毒感染带来的公共卫生负担。