中性粒细胞来源的肝素结合蛋白（HBP）通过 TRIM21/P65 轴调控急性肺损伤新机制及潜在疗法

为探究脓毒症中性粒细胞与内皮功能障碍关系，研究人员聚焦 HBP，发现 HBP/TRIM21/P65 轴可调控 ALI，为治疗提供新策略。

　　急性肺损伤（ALI），这个名字听起来或许有些陌生，但它却如同隐藏在暗处的杀手，严重威胁着人们的健康。ALI 是一种由肺内或肺外因素引发的、危及生命的非心源性肺水肿，会导致急性低氧性呼吸衰竭。它的典型病理特征包括广泛的肺泡损伤、血管通透性增加和中性粒细胞浸润，这些变化会协同破坏气体交换，损害呼吸功能。随着病情恶化，ALI 还会发展成更严重的急性呼吸窘迫综合征（ARDS）。而脓毒症，作为 ARDS 最常见的病因，是机体对感染的异常反应，会引发炎症级联反应，损伤内皮和上皮细胞，加重肺泡 - 毛细血管屏障的破坏，进而导致肺水肿。尽管医疗技术不断进步，脓毒症相关 ARDS 患者的院内死亡率仍高达 40%，给患者、家庭和社会带来了沉重的负担。

在这场与疾病的斗争中，内皮细胞（EC）单层就像一道守护肺部的城墙，调节着血液和间质之间的液体、营养物质和细胞交换。人类肺微血管内皮细胞（HPMECs）的完整性对维持肺部功能至关重要，然而，在脓毒症期间，病原体相关分子模式和损伤相关分子模式会破坏内皮完整性，增加血管通透性，导致肺损伤。同时，ECs 会从静止状态迅速转变为高炎症和激活状态，这一过程与脓毒症和炎症期间糖酵解的动态变化密切相关，糖酵解在 ALI 的进展中也起着重要作用。因此，EC 通透性和糖酵解成为了治疗肺损伤的潜在靶点。

中性粒细胞在免疫防御中发挥着关键作用，它能通过多种方式调节 ALI。肝素结合蛋白（HBP），作为中性粒细胞分泌的一种物质，在脓毒症时会释放到血液中，是感染严重程度和发展为严重脓毒症的生物标志物。此前研究发现 HBP 可通过与内皮转化生长因子 - β 受体 2 相互作用，激活相关信号通路，引发 ALI，但它对内皮屏障、糖酵解和内皮功能障碍的调控作用尚不明确。此外，TRIM21 作为一种与多种免疫和炎症过程相关的蛋白，其在 HBP 介导的内皮功能障碍中的作用也有待研究。P65 是 NF - κB 家族的关键成员，与 ALI 等疾病中 NF - κB 通路的异常激活有关，HBP 对 P65 转录活性的调控机制同样未知。

为了深入了解这些未知领域，中国医科大学附属第一医院重症医学科的研究人员 Jian Zhang、Yong Cao、Wenqi Shu 等开展了一系列研究，相关成果发表在《Cell Biology and Toxicology》杂志上。

研究人员为开展此项研究，运用了多种关键技术方法。他们收集了中国医科大学附属第一医院重症监护室脓毒症患者的临床数据，包括血浆 HBP 浓度，并采集了健康供体和脓毒症患者的血液样本用于中性粒细胞的分离。在细胞实验方面，培养了 HPMECs 并进行多种处理和转染操作，通过共免疫沉淀（Co - IP）和质谱分析筛选与 HBP 相互作用的蛋白。在动物实验中，选用 C57/BL 雄性小鼠构建 HBP 诱导的肺损伤模型和脂多糖（LPS）诱导的急性肺损伤模型，运用了多种检测技术，如蛋白质免疫印迹（Western blot）、酶联免疫吸附测定（ELISA）、免疫荧光染色等，来检测相关蛋白的表达、定位及细胞和组织的各项指标变化。

下面来看具体的研究结果：

1. 中性粒细胞来源的 HBP 导致 HPMEC 屏障破坏和糖酵解增加：研究人员分析了脓毒症患者血浆 HBP 浓度，发现脓毒症合并 ARDS 患者的血浆 HBP 水平显著高于无肺损伤的脓毒症患者。在 Transwell 共培养实验中，与健康中性粒细胞相比，脓毒症来源的中性粒细胞与 HPMECs 共培养时，上清液中 HBP 水平更高，且会导致 HPMECs 的跨内皮电阻（TEER）值降低、FITC - 葡聚糖泄漏增加、紧密连接蛋白表达下降，同时糖酵解能力和乳酸水平升高。而肝素作为 HBP 的非特异性拮抗剂，可改善这些变化，表明肝素能有效减轻脓毒症中性粒细胞诱导的 HPMEC 通透性增加和糖酵解增强。
2. 重组 HBP 增加 EC 通透性和糖酵解，导致 ALI：在体内外实验中，使用重组 HBP 处理 HPMECs 和小鼠。结果显示，HBP 处理的 HPMECs 出现 TEER 值下降、FITC - 葡聚糖泄漏增加、紧密连接蛋白表达降低、糖酵解能力增强和乳酸水平升高的现象。静脉注射 HBP 的小鼠出现严重肺损伤，肺湿干比（W/D）和伊文思蓝染料渗出增加，支气管肺泡灌洗液（BALF）中乳酸水平升高，证实 HBP 可诱导 HPMEC 通透性增加和糖酵解增强，加重 ALI。
3. HBP 与 TRIM21 相互作用并增加其蛋白质稳定性：通过 Co - IP 和质谱分析，研究人员发现 TRIM21 是 HBP 在 HPMECs 中的潜在相互作用蛋白。进一步实验证实了两者的内源性相互作用，免疫荧光分析显示它们在细胞质中共定位。虽然 HBP 过表达不影响 TRIM21 的 mRNA 水平，但可显著增加其蛋白质水平，通过使用环己酰亚胺（CHX）和蛋白酶体抑制剂 MG132 处理细胞发现，HBP 通过抑制 K48 泛素化来增强 TRIM21 的蛋白质稳定性。
4. TRIM21 对 EC 通透性和糖酵解的调节作用：在 HPMECs 中进行 TRIM21 的过表达和敲低实验，结果表明，TRIM21 过表达会降低 TEER 值、增加 FITC - 葡聚糖泄漏、降低紧密连接蛋白表达、提高糖酵解活性和乳酸生成；而 TRIM21 敲低则产生相反的效果，说明 TRIM21 可调节内皮屏障功能和糖酵解活性。
5. TRIM21 通过 P65 核转位调节 EC 通透性和糖酵解：Co - IP 实验证实了 HPMECs 中 TRIM21 与 P65 的内源性相互作用。TRIM21 过表达可增加 P65 的 K63 连接泛素化和核转位。使用 P65 核转位特异性抑制剂 JSH - 23 处理细胞后，发现其可逆转 TRIM21 过表达导致的 TEER 值降低、FITC - 葡聚糖泄漏增加、紧密连接蛋白表达下降以及糖酵解能力和乳酸水平升高的现象，表明 TRIM21 通过 P65 核转位调节 HPMEC 通透性和糖酵解。
6. HBP 增强 TRIM21 与 P65 的相互作用，通过 TRIM21 介导的 P65 泛素化调节 EC 通透性和糖酵解：Co - IP 实验表明，重组 HBP 和脓毒症来源的中性粒细胞均可增强 TRIM21 与 P65 的内源性相互作用。在 HPMECs 中敲低 TRIM21 后，可抑制 HBP 过表达导致的 P65 磷酸化和核转位，同时恢复紧密连接蛋白的表达，降低糖酵解能力和乳酸水平，证实 HBP 通过促进 TRIM21 与 P65 的相互作用，影响 HPMEC 通透性和糖酵解。
7. 沉默 TRIM21 可逆转 HBP 诱导的体内肺损伤：在 HBP 处理的小鼠中，肺组织中 TRIM21 表达增加，其泛素化水平降低，P65 的 K63 泛素化减少，同时 BALF 中中性粒细胞含量增加。使用表达 shRNA 靶向 TRIM21 的腺相关病毒（AAV6）载体处理小鼠后发现，敲低 TRIM21 可显著减轻 HBP 诱导的肺部病理损伤、降低肺 W/D 比、减少伊文思蓝泄漏和 BALF 中乳酸水平，在 LPS 诱导的肺损伤模型中也得到了类似的结果，表明 TRIM21 可能参与多种病因引起的肺损伤。

综上所述，本研究揭示了 HBP/TRIM21/P65 轴在脓毒症期间调节肺内皮屏障功能和代谢重编程中的关键作用。HBP 与 TRIM21 结合，抑制其 K48 泛素化，促进 TRIM21 表达，并增强 TRIM21 与 P65 的相互作用，促进 P65 磷酸化和核转位，形成正反馈回路，放大 NF - κB 信号。体内外敲低 TRIM21 可有效逆转 HBP 诱导的通透性增加和糖酵解增强，减轻肺损伤。这一研究首次阐明了 ALI 中 HBP - TRIM21 - P65 信号轴的分子相互作用，为急性肺损伤的治疗提供了新的潜在治疗策略。然而，研究也存在一些局限性，如实验模型与人类脓毒症实际情况存在差异、使用的抑制剂不够精准、未明确蛋白间结合位点以及病毒感染缺乏细胞特异性等。未来还需要进一步研究来解决这些问题，推动急性肺损伤治疗领域的发展。