RNA 测序技术新突破：深度解析转录组，解锁生命密码

研究人员针对 RNA 分析难题，开展 RNA 测序技术研究，开发多种新方法，助力生命科学研究。

　　RNA，这个在生命舞台上扮演着关键角色的分子，一直以来都是科学家们重点研究的对象。在过去，测定人类基因组那约 31 亿个碱基，耗费了 13 年之久。而如今，现代高通量的下一代测序（NGS）技术的出现，让核酸测序领域发生了翻天覆地的变化。它能够在短时间内对大量 DNA/RNA 片段进行测序，其通量相当于能在一次运行中对超过 40 个人类基因组进行 30 倍覆盖度的测序，这不仅大大缩短了全基因组测序的时间，还为转录组分析开辟了新道路。

转录组是指细胞或组织中所有转录本的集合，对它的分析有助于深入了解基因表达调控、细胞功能以及疾病发生发展的机制。RNA 测序（RNA-Seq）作为一种高通量分析转录组的方法，通过将 RNA 分子逆转录为互补 DNA（cDNA），然后进行测序，最初主要用于 RNA 分子的定量和特征描述。但随着研究的深入，人们发现 RNA-Seq 数据蕴含的信息远不止序列信息这么简单。

不过，在 RNA 研究的道路上，仍有许多难题亟待解决。例如，在研究 tRNA（转运 RNA，在蛋白质合成过程中起着转运氨基酸的关键作用）时，传统的研究方法存在诸多缺陷。在制备测序文库的过程中，tRNA 片段容易丢失，而且 tRNA 上的修饰可能会导致 cDNA 合成提前终止，从而影响对 tRNA 的全面分析。此外，由于 tRNA 存在大量化学修饰，其基因组位点又具有重复性，这使得 tRNA 的 reads（测序得到的短序列片段）与参考基因组的比对变得困难且容易出错。同时，RNA 的空间结构以及修饰模式等方面的研究也面临着技术挑战。

为了攻克这些难题，来自德国莱比锡大学（University of Leipzig）等机构的研究人员 Tim Kolberg、Anne Hoffmann、Mario M?rl、Peter F. Stadler 等人开展了一系列研究。他们的研究成果发表在《BIOspektrum》杂志上，为 RNA 研究领域带来了新的曙光。

研究人员在研究过程中运用了多种关键技术方法。在 tRNA 分析方面，开发了 YAMAT-Seq（Y-shaped Adapterligated MAture TRNA sequencing）和 LOTTE-Seq（long hairpin oligonucleotide based tRNA high-throughput sequencing）技术。在 RNA 结构分析方面，运用了 SHAPE（selective 2′-hydroxyl acylation analyzed by primer extension）和新开发的 Led-Seq（Ligation-Enhanced Double-End Sequence-Based Structure Analysis of RNA）技术。同时，还采用了一种特殊的 tRNA reads 比对策略，以解决 tRNA reads 映射难题。

研究结果如下：

1. tRNA 文库构建方法：YAMAT-Seq 技术利用 Y 形碱基配对的寡核苷酸接头，其单链区域与 tRNA 的 CCA 末端反向互补，通过特异性杂交，可使接头连接到 tRNA 的 5′和 3′末端，后续的 RT-PCR 能够生成仅包含完整 tRNA 序列的测序文库，避免了修饰导致的部分 cDNA 或 tRNA 片段的遗漏。LOTTE-Seq 技术则是让发夹状寡核苷酸接头与 tRNA 的 CCA 末端杂交，连接后将 tRNA 逆转录为 cDNA，再在 cDNA 的 3′末端连接第二个接头用于文库构建，该方法不仅能捕获完整 tRNA 序列，还能检测 tRNA 序列片段。
2. RNA 结构分析方法：SHAPE 技术通过化学修饰核糖的 2′- 羟基来标记 RNA 的柔性和未配对区域，这种修饰不受碱基身份的影响。修饰后的 RNA 在逆转录后，单链区域会呈现出特征性的终止或突变模式，从而可以读取结构信息，为构建精确的二级结构模型提供依据。Led-Seq 技术基于铅离子切割 RNA，利用拟南芥 RNA 连接酶（AtRNL）和大肠杆菌 RtcB 连接酶的特异性连接机制，将寡核苷酸接头连接到 2′,3′-cP 或 5′-OH 携带的 RNA 分子上，标记切割位置，通过后续的逆转录和测序推断 RNA 的二级结构。而且，该技术通过分析两个切割产物，确保在 RNA 的 5′和 3′末端附近总有一个测序文库具有信息性。
3. tRNA reads 精确映射：研究人员开发的特殊 tRNA reads 比对策略，基于修饰后的目标基因组，先去除跨越人工前体 tRNA 染色体边界的 reads，保留成熟 tRNA reads，再将剩余 reads 与 tRNA 簇进行比对，合并相同的 tRNA，减少了多次映射的 reads 数量，实现了 tRNA reads 的精确映射，有助于准确识别 tRNA 的化学修饰。

研究结论和讨论部分，这些研究成果具有重要意义。多种针对 tRNA 分析和 RNA 结构分析的新技术，为深入了解 tRNA 的组成、动态变化以及 RNA 的结构和修饰模式提供了有力工具。精确的 tRNA reads 映射策略提高了研究的准确性，能够可靠地识别 tRNA 的化学修饰，有助于探究不同重复 RNA 家族（如微小 RNA、小核仁 RNA 和小核 RNA）的修饰模式及其发展变化。此外，研究人员展望了 RNA 测序技术的未来发展，认为现有测序方法的改进和第三代测序技术（如纳米孔测序）的应用，将进一步提升 RNA 分析的能力，为研究不同细胞类型或不同条件下 tRNA 的异质表达、结构复杂性和修饰提供更多可能，有望推动生命科学和健康医学领域的进一步发展。