光驱动洗脱：蛋白质纯化的新曙光 ——Excitography 技术突破

《BIOspektrum》：Ein Licht am Ende der Proteinreinigung

为解决亲和层析（Affinit?tschromatographie）纯化重组蛋白时，目标蛋白（POI）洗脱条件非生理、易污染杂质的问题，研究人员开展 “Excitography（光驱动洗脱亲和层析）” 研究。结果显示该方法能有效纯化多种蛋白，意义在于实现生理缓冲液直接洗脱，提升蛋白纯度。

　　

在生命科学研究和生物制药领域，蛋白质纯化是一项至关重要的基础工作。无论是深入探究蛋白质的特性，还是将其应用于生物制药，都离不开高纯度的蛋白质。目前，亲和层析是常用的蛋白质纯化方法之一，其中 His - Tag 和 Strep - Tag 是非常突出的亲和标签。然而，这种方法存在明显的弊端。使用亲和层析纯化时，目标蛋白（POI）大多在非生理缓冲液中洗脱，而且会被配体和其他缓冲液成分污染。这就意味着，往往还需要额外的纯化步骤，不仅增加了实验成本和时间，也可能影响蛋白质的活性和纯度。为了解决这些问题，科研人员一直在寻找更高效、更优质的蛋白质纯化方法。在这样的背景下，来自德国格赖夫斯瓦尔德大学（Universit?t Greifswald）的研究人员开展了一项具有创新性的研究。他们提出了一种全新的蛋白质纯化方法 ——Excitography，即光驱动洗脱亲和层析。该研究成果发表在《BIOspektrum》上。这一研究的开展，为蛋白质纯化领域带来了新的希望。研究人员在这项研究中运用了多种关键技术方法。首先是利用非天然氨基酸 P -(Phenylazo)-L-Phenyl alanin（Pap），它在不同光照条件下会发生构型转变。通过定点突变技术，将 Pap 作为 Azo - Tag 引入目标蛋白中。同时，制备了一种特殊的柱材料，是由共价固定在环氧活化琼脂糖上的 α - 环糊精（α -CD）构成。在纯化过程中，细胞提取物上柱，目标蛋白与 α -CD 基质结合，随后利用 355nm 的紫外光照射实现目标蛋白的洗脱。下面详细介绍研究结果：

• 光驱动洗脱原理：非天然氨基酸 Pap 在自然光下呈反式（trans）构型，在 355nm 紫外光激发下会转变为顺式（cis）构型。研究发现，trans - Pap 对 α -CD 具有很强的亲和力（KD?=91μM），而 cis - Pap 与 α -CD 几乎没有可测量的亲和力。基于这一特性，研究人员设计了上述柱材料。当细胞提取物加入柱中时，带有 Azo - Tag（Pap）的目标蛋白会与 α -CD 基质结合。此时，通过 355nm 紫外光照射柱子，Azo - Tag 构型转变，目标蛋白就会从柱上洗脱下来。
• 纯化效果验证：研究人员对多种蛋白质进行了实验，包括抗体片段等。结果表明，利用 Excitography 方法能够有效地纯化这些蛋白质。而且，Azo - Tag 可以在对氨基酸序列影响最小的情况下，添加在目标蛋白的 N 端或 C 端。这意味着该方法具有很强的通用性，能够适用于多种不同类型的蛋白质纯化。
• 柱材料性能：研究还发现，这种柱材料对常用的生化试剂（如 DTT、TCEP、GdnHCl）具有较好的耐受性，表现出较强的稳定性。此外，每 1ml 柱体积可以纯化超过 10mg 蛋白质，且不会导致柱子过载。这说明该方法在实际应用中具有较高的效率，能够满足一定规模的蛋白质纯化需求。从研究结论和讨论部分来看，Excitography 方法具有多方面的重要意义。它最大的优势在于可以使用生理缓冲液直接洗脱目标蛋白，避免了传统亲和层析中目标蛋白在非生理缓冲液中洗脱带来的潜在问题，如蛋白质变性等。同时，该方法获得的蛋白质纯度较高，Azo - Tag 的尺寸较小，对目标蛋白的结构和功能影响较小。而且，整个纯化过程操作相对简单，易于在实验室和工业生产中推广应用。当然，目前该方法也存在一些局限性，例如目标蛋白的表达因非天然氨基酸的引入变得更具挑战性，并且目前该方法（暂时）局限于特定的表达菌株。但总体而言，这项研究为蛋白质纯化提供了一种全新的思路和方法，为后续进一步优化蛋白质纯化技术奠定了基础，有望在生命科学研究和生物制药领域发挥重要作用，推动相关领域的发展。