CRISPR技术助力抗生素耐药废水检测

抗生素耐药性是一个全球性问题，威胁着我们预防和治疗人类和动物细菌感染的能力。

　　

抗生素抗性是全球性问题，威胁着人类和动物预防及治疗细菌感染的能力。为更好地监测抗性基因（ARGs）的出现和传播，美国伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校Carl R. Woese基因组生物学研究所的研究人员开发了一种基于CRISPR富集的宏基因组学方法，用于增强对废水中药物抗性基因的监测。

抗生素虽是现代医学中对抗感染的有力工具，但细菌会随着时间推移对抗生素产生适应性变化，从而降低其有效性。此外，医疗和食品行业对抗生素的过度使用和滥用进一步加剧了这一问题。除了直接接触抗生素外，抗性还会通过细菌DNA片段（即抗性基因）在不同细菌之间的传递而扩散。目前已鉴定出超过5000种ARGs，这些基因不仅存在于临床样本中，还广泛存在于来自医院、农场和污水处理系统的水体中。

ARGs会削弱用于治疗细菌感染的药物的有效性。废水中的ARGs检测对于公共卫生机构和医生来说至关重要，它可以帮助他们预测社区中正在流行的抗性类型。

废水样本中包含来自人类、病毒和细菌等多种来源的大量不同ARGs。由于ARGs仅占总DNA含量的极小部分，因此在废水样本中检测它们需要灵敏度更高的方法。目前最常用的技术是定量聚合酶链反应（qPCR）。这种方法利用称为引物的RNA引导物来识别已知ARGs的特定DNA序列，并将其扩增以便检测。

“qPCR是一种灵敏度很高的方法，许多公共卫生领域的人员都经过了相关培训，但它需要设计和验证引物，这非常耗时。”论文第一作者、伊利诺伊大学土木与环境工程专业的博士生Yuqing Mao表示，“由于qPCR只用于提取目标基因序列，样本中其他所有遗传物质仍然完全未知。”

另一种方法是宏基因组学，虽然其灵敏度不如qPCR，但可以更全面地呈现样本中的遗传信息。宏基因组学涉及将样本中的所有DNA随机分解成数百万个小片段，然后利用新一代测序技术同时对这些片段进行测序。通过计算算法将这些片段拼接成完整的DNA序列，并与数据库进行比对以确定其身份。

“ARGs在样本DNA中占比不到1%，可能更接近0.1%。使用标准宏基因组学方法，检测到的99.9%的DNA与ARGs无关。”Yuqing Mao说。

为了增加样本中与ARGs相关的片段数量，Yuqing Mao、Helen Nguyen教授及其合作者、伊利诺伊大学微生物学系的Joanna Shisler博士利用了CRISPR-Cas9系统——一种高效的基因编辑工具。在标准宏基因组学方法中，DNA会在随机位置被分解，但引入CRISPR-Cas9后，可以在ARGs内进行靶向分解。通过设计6010种不同的引导RNA，使其能够特异性地结合到ARGs不同位点的DNA上，Cas9蛋白可以被引导到这些位置进行切割。

“我们的新CRISPR方法增加了样本中ARG片段的丰度，从而提高了它们被检测到的机会。与PCR相比，CRISPR在多重检测方面具有更大的潜力，因为CRISPR的分子相互作用更简单、更直接。”Yuqing Mao说。

他们的新方法将ARGs的检测限降低了1个数量级，从10⁻⁴降低到10⁻⁵，并在废水样本中发现了1189个更多ARGs和61个更多ARG家族，这些ARGs和家族的丰度较低。

作为六年级研究生，Yuqing Mao从零开始构建了这个项目，克服了科学障碍，并在此过程中学习了许多新技能。她说：“当我第一次得到测序结果时，从未想过它会比常规方法灵敏得多——它检测到的ARGs比我们预期的要多得多。完成这个项目后，我觉得自己成长了许多。”

尽管这个项目已经结束，但课题组已经在探索多个新方向，包括将他们的CRISPR-Cas9宏基因组学方法扩展到更广泛的环境样本，并利用这些结果指导新的qPCR引物设计。