新型 CRISPR-Cas9 基因编辑 iPSC 敲除模型：推进丙酸血症研究的新利器

研究人员利用 CRISPR-Cas9 技术构建 PCCA和PCCB 基因敲除 iPSC 系，为丙酸血症研究提供新模型，意义重大。

　　丙酸血症（Propionic acidemia，PA）是一种极为罕见的常染色体隐性遗传代谢疾病，就像隐藏在人体代谢系统中的 “定时炸弹”。它由 PCCA 和 PCCB 基因发生突变引起，这两个基因所编码的是线粒体酶丙酰辅酶 A 羧化酶（Propionyl-CoA carboxylase，PCC）的亚基。PCC 在某些氨基酸和脂质的分解代谢过程中起着至关重要的作用，一旦 PCCA 和 PCCB 基因出现问题，PCC 的活性就会大打折扣，有毒代谢物便会在体内大量堆积，进而引发严重的代谢功能障碍。

PA 患者的心脏和大脑往往会受到显著影响，这也是导致患者发病和死亡的主要原因。在心脏方面，常见的并发症包括 QT 间期延长、心肌肥厚以及扩张型心肌病，严重时甚至会引发致命的心律失常；而在神经系统方面，患者会出现认知障碍、发育迟缓、智力残疾等一系列问题，还可能伴有神经精神运动发育的结构缺陷和紊乱。尽管早期诊断和干预对缓解 PA 患者重要器官的损伤至关重要，但目前的治疗手段十分有限，这就迫切需要深入研究 PA 的发病机制，探索更有效的治疗方法。

在此背景下，来自西班牙多个研究机构（Centro de Biología Molecular Severo Ochoa UAM-CSIC、Instituto Universitario de Biología Molecular、Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Raras (CIBERER)、Instituto de Investigación Sanitaria Hospital La Paz (IdiPaz)）的研究人员 Emilio M. García-Tenorio、Mar álvarez 等人开展了相关研究。他们的研究成果发表在《Human Cell》杂志上，为 PA 的研究开辟了新的道路。

研究人员主要运用了 CRISPR-Cas9 基因编辑技术（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-Cas9，一种强大的基因编辑工具）。实验所用的人类诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs，具有分化成多种细胞类型的潜力）来源于健康女性供体的外周血单个核细胞。通过一系列复杂而精细的操作，研究人员成功构建了 PCCA 和 PCCB 基因敲除（Knockout，KO）的 iPSC 系。

下面来看具体的研究结果：

• PCCA 和 PCCB 基因敲除 iPSC 系的生成：研究人员精心设计了针对 PCCA 和 PCCB 基因关键区域（外显子 5）的向导 RNA，利用 CRISPR-Cas9 和单导向 RNA 核糖核蛋白（RNP）复合物进行转染。经过筛选，成功获得了带有双等位基因移码突变的 iPSC 克隆。例如，在 PCCA^KO iPSC 系中发现了两种移码突变，分别是 2 碱基缺失（c.411_412del）和 5 碱基缺失（c.413_414 + 3del）；在 PCCB^KO iPSC 系中，选择的克隆为复合杂合突变，一个等位基因有 1 碱基插入（c.448_449insC），另一个等位基因有 4 碱基缺失和 2 碱基插入（c.446_449delinsCT）。这些突变均导致了提前终止密码子的出现，经过多种检测方法证实，相应的转录本、蛋白质表达和酶活性都消失了，这表明成功构建了基因敲除细胞系123。
• PCCA 和 PCCB 基因敲除 iPSC 系的特征鉴定：对构建的基因敲除 iPSC 系进行全面的特征鉴定后发现，它们具有典型的干细胞形态，细胞紧密堆积形成集落，核质比大且核仁明显。通过核型分析表明，细胞系的染色体完整性正常（46，XX）。免疫荧光染色和流式细胞术分析显示，多能性标记物（如 OCT4、SOX2、NANOG、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1–60 和 TRA-1–81）表达强烈，这意味着这些细胞系保持着多能性。此外，通过体外三胚层分化实验，证实了它们具有分化为内胚层、中胚层和外胚层的能力。短串联重复序列（STR）分析验证了细胞身份，支原体检测表明细胞系未被污染456。

从研究结论和讨论部分来看，此次研究意义非凡。研究人员成功构建了 PCCA 和 PCCB 基因敲除的 iPSC 系，这些细胞系基因组完整且保持多能性，为研究 PA 的分子和病理生理机制提供了宝贵的同基因系统，也为探索潜在的治疗干预措施提供了有力工具。由于 PA 患者目前治疗选择有限，常遭受不可逆的脑部并发症，而现有的 PA 相关细胞模型无法研究神经系统改变。基于此，研究人员计划利用这些基因敲除 iPSC 系开发脑类器官，进一步深入研究 PA 相关的神经学和生物学复杂性，这对于理解 PA 的发病机制以及开发新的治疗策略具有重要的推动作用。

总的来说，这项研究为丙酸血症的研究带来了新的希望和方向，其构建的基因敲除 iPSC 系为后续研究奠定了坚实的基础，有望在未来推动丙酸血症治疗领域取得重大突破。