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研究人员针对丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）发酵产溶剂面临的问题开展研究，发现多种优化策略，为可持续生产提供方向。
研究背景
在能源与化工领域，可持续发展的需求日益迫切。利用丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）通过 ABE（acetone-butanol-ethanol，丙酮 - 丁醇 - 乙醇）发酵生产丁醇的技术，有着一段跌宕起伏的百年历史。一战时期，由于天然橡胶短缺，对合成橡胶需求大增，该技术应运而生，当时丙酮在火药生产中至关重要，这极大地推动了 ABE 发酵技术的发展。到 1945 年，全球 66% 的丁醇都由发酵法生产。但随着石化产业兴起，廉价的石化产品使得 ABE 发酵技术逐渐落寞，其主要限制因素包括丁醇的毒性导致产物浓度低，以及高昂的回收成本。
如今，情况发生了转变。化石资源逐渐枯竭，油价不断攀升，人们对可再生能源的关注度与日俱增。丁醇，因其具有高达29.2MJ?L?1的能量密度，且吸湿性比乙醇低，被视为极具潜力的生物燃料。在这样的背景下，ABE 发酵技术再次进入人们的视野，重新成为科研领域的研究热点。然而，该技术在实际应用中仍面临诸多挑战，如菌株退化、溶剂毒性、底物成本高昂以及产量较低等问题，这些都严重限制了其大规模生产。为了克服这些难题，推动 ABE 发酵技术的发展，来自德国凯撒斯劳滕 - 兰道大学（RPTU Kaiserslautern-Landau）的研究人员开展了一系列深入研究，相关成果发表在《Applied Microbiology and Biotechnology 》上。
研究方法
- 文献综述法：研究人员广泛查阅了大量与丙酮丁醇梭菌培养相关的文献，涵盖了从早期的基础研究到近期的前沿进展，全面梳理了该领域的研究现状和存在的问题。
- 实验研究法：通过进行细胞保存、预培养、主培养等实验，研究不同条件对丙酮丁醇梭菌生长和溶剂生产的影响。例如，对比不同的细胞保存方法、预培养条件以及主培养的发酵方式（批次发酵、连续发酵等），观察菌株的生长特性、代谢产物的生成情况等。同时，对共培养、生物电化学系统（BES）等新兴技术进行实验探索，评估其对提高溶剂产量和发酵效率的作用。
研究结果
- 细胞保存：菌株退化是工业溶剂生产中的关键问题，它由遗传变化引发，会导致产溶剂能力丧失。早期，工业上常将细胞以孢子形式保存在无菌沙子、土壤或液体培养基中，如今冷冻保存技术更为常用。研究发现，在低温下用甘油保存处于稳定期的细胞，能在后续培养中获得更高数量的活细胞，维持溶剂生产效率。这是因为稳定期与溶剂生产和孢子形成相关，孢子的形成增强了细胞对冷冻过程的抵抗力。
- 预培养：标准化的预培养流程对主培养的结果重现性和可比性至关重要，但许多文献对预培养条件的描述并不详细。研究表明，预培养的温度通常为 35 - 37°C，转速 150 - 200 rpm，接种量为 10 vol% 。培养基的 pH 值对细胞生长影响显著，以冷冻培养物为接种物时，细胞仅在 pH 5.0 - 6.2 的范围内生长。此外，接种时细胞的生长阶段也会影响主培养中的酸和溶剂生产，使用稳定期收获的细胞能确保主培养中可靠的溶剂生产，而无需严格的 pH 控制。
- 主培养：从早期到中期，ABE 发酵在多个国家实现了工业化生产，采用的是批次发酵后蒸馏的工艺。在批次发酵过程中，控制从产酸阶段（acidogenesis）到溶剂生成阶段（solventogenesis）的代谢转变是成功生产溶剂的关键。pH 值在这个过程中起着重要作用，通过 pH 控制防止 pH 低于 4.5 可确保代谢转变，但过高的 pH 值又会阻碍这一转变。此外，全球调节因子 Spo0A 及其磷酸化在代谢转变中也起着关键作用。目前，研究人员还关注到连续培养的方式，通过细胞固定化等技术可以提高发酵的生产力和稳定性。例如，使用纤维床生物反应器固定细胞进行连续丁醇生产，能达到较高的生产力和丁醇浓度。
- 原位产物去除（ISPR）：溶剂的细胞毒性是 ABE 发酵的主要限制因素之一，会导致代谢抑制。为解决这一问题，研究人员探索了多种 ISPR 方法，包括萃取、吸附、渗透汽化和汽提等。这些方法能够提高溶剂生产效率，如在 5 - L 中试规模的填充床生物反应器中，采用萃取和汽提相结合的原位回收工艺，实现了较高的丁醇生产力；使用 Optipore L - 493 树脂吸附丁醇，使 ABE 发酵的产量提高了 2.3 倍。
- 可持续性与改进溶剂生产的新趋势
- 发酵可再生资源：利用可再生资源，尤其是木质纤维素生物质进行发酵，是实现可持续溶剂生产的重要途径。木质纤维素生物质来源广泛，如农业废弃物、食品工业废料等。但由于其结构复杂，需要进行预处理，常用的预处理方法包括物理、化学、物理化学和生物方法等。经过预处理和酶糖化后，其中的糖类可被丙酮丁醇梭菌利用。研究发现，该菌株能够代谢多种来自木质纤维素生物质的糖类，但存在碳分解代谢物阻遏（CCR）现象，即优先利用葡萄糖，抑制戊糖的利用。不过，通过基因工程手段可以解决这一问题。
- 生物电化学系统（BES）：在 BES 中，通过向系统中添加外部电子，可引导丙酮丁醇梭菌的代谢朝着生成更多丁醇的方向进行。研究表明，施加特定的电位能够影响菌株的双相代谢，使代谢从产酸阶段更早地转变为溶剂生成阶段，还能上调与丁醇生产相关的关键酶的表达，从而提高丁醇产量。
- 代谢工程：代谢工程是提高丙酮丁醇梭菌丁醇产量和溶剂耐受性的重要手段。通过基因编辑技术，如 CRISPR/Cas9，研究人员可以对菌株进行精准改造。例如，敲除某些基因可以提高菌株的溶剂耐受性和丁醇产量，异源表达其他生物的基因也能优化菌株的溶剂生产能力。
- 共培养：基于丙酮丁醇梭菌单一培养存在的局限性，如溶剂毒性、底物利用范围有限等，研究人员探索了共培养策略。共培养可以分为不同类型，如共生共培养中，一种微生物利用另一种微生物的副产物或代谢物，从而促进溶剂生产；分工共培养中，不同的梭菌物种利用各自互补的底物利用能力，提高底物利用率；还有与具有纤维素分解活性的细菌或真菌进行共培养，可拓宽底物范围，生产酯类等更多有价值的产品。
研究结论与意义
本研究全面综述了丙酮丁醇梭菌培养的现状，从细胞保存、预培养到主培养的各个环节，深入探讨了提高发酵效率和溶剂产量的多种策略。研究发现，通过优化培养条件、采用原位产物去除技术、利用可再生资源、开展共培养以及进行代谢工程改造等方法，可以有效解决丙酮丁醇梭菌发酵面临的诸多问题。这些研究成果为 ABE 发酵技术的进一步发展提供了理论基础和实践指导，使得丙酮丁醇梭菌在可持续丁醇生产方面展现出巨大的潜力，有望推动生物基经济的发展，为实现可持续能源和化工生产目标迈出重要一步。同时，研究也指出了目前存在的挑战，如某些技术在工业化规模应用中的优化问题，为后续研究指明了方向。
