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为探究植物病毒复制机制及防治策略，研究人员解析番茄斑萎病毒（TSWV）聚合酶结构，发现利巴韦林可双靶点抑制，助力抗病毒农药研发。
# 植物病毒研究新突破：解析番茄斑萎病毒复制机制与靶向抑制策略
在病毒的微观世界里，植物病毒如同隐藏在农作物中的 “暗箭”，时刻威胁着全球粮食安全。自 19 世纪末烟草花叶病毒被发现，开启了病毒学研究的大门，植物病毒研究也为现代病毒学和分子生物学发展立下汗马功劳。然而，这些 “暗箭” 至今仍让农业生产防不胜防。目前，全球已知的植物病毒超过 2100 种，它们每年给农作物带来的经济损失超 300 亿美元，可一旦植物被病毒感染，却没有有效的抗病毒药物进行治疗。
为了攻克这一难题，南京农业大学和中国科学院生物物理研究所等机构的研究人员展开了深入研究，相关成果发表在《Nature Plants》杂志上。
研究人员聚焦于番茄斑萎病毒（TSWV），它是一种在全球范围内肆虐的负链植物 RNA 病毒，其编码的 RNA 依赖的 RNA 聚合酶（RdRp，又称 L 蛋白）是植物病毒中最大的聚合酶之一。研究人员利用低温冷冻电镜技术（cryo-EM），解析了 TSWV 全长 RNA 聚合酶的结构，这就像是为病毒的 “核心工厂” 绘制了一份精细的蓝图，让我们得以一窥其内部的运作机制。
研究人员运用了多种关键技术方法。在蛋白研究方面，通过对 TSWV 的 L 蛋白进行表达和纯化，获取研究样本；利用 cryo-EM 技术制备样本并收集数据，为解析结构提供基础；借助图像处理和模型构建与优化手段，确定蛋白及相关复合物的结构。在病毒研究领域，构建传染性克隆并接种病毒，观察病毒感染情况；使用抗病毒药物处理植物叶片，探究药物效果；运用荧光显微镜、免疫印迹、RNA 提取与印迹分析、电泳迁移率变动分析（EMSA）及体外 RdRp 活性测定等技术，从不同角度分析病毒感染、蛋白和 RNA 表达、蛋白与 RNA 结合及聚合酶活性等情况 。
下面来看看具体的研究结果：
- 整体结构：成功解析了无 RNA 结合的 L 蛋白（apo L）和与病毒基因组 RNA 结合的 L 蛋白（RNA-bound L）的结构。TSWV L 蛋白可分为三个区域，与流感病毒聚合酶亚基类似，其核心区域形成球状结构。在解析过程中发现，添加病毒 RNA 启动子会使聚合酶核心区域和内切核酸酶（endo）区域变得有序，分辨率也得到提高。
- vRNA 启动子结合后的构象变化：TSWV 的 vRNA 5′和 3′末端形成连续双链区域，包括近端和远端双链，这与流感病毒和其他布尼亚病毒聚合酶不同。结合 vRNA 启动子后，L 蛋白发生显著构象变化，多个亚结构域移动，使聚合酶核心更紧密，endo 区域有序化，稳定了 RNA 结合区域，指尖（motif F）和引物环等关键功能元件也得以稳定，形成稳定的催化中心。
- 5′ 钩状 vRNA 足以激活聚合酶：5′端 vRNA 的 1 - 10 位核苷酸形成的钩状结构能激活 L 蛋白。研究发现，钩状结构与 motif F 的相互作用中，5′端 C5 与 motif F 上的 Lys1291 形成的氢键至关重要，且 Lys1291 在正番茄斑萎病毒聚合酶中高度保守。通过对 TSWV 感染性克隆进行突变实验，进一步验证了该位点及相关氨基酸残基对病毒复制的重要性。
- 完整催化中心的形成：motif F 与手指和核心叶区域存在直接极性相互作用，其中与保守残基 Gln1455 形成氢键，同时发现新的保守基序 I（Lys1008），它在所有布尼亚病毒 L 蛋白中绝对保守。对其他病毒聚合酶结构分析发现，motif I 在不同病毒中均存在，且位置相似。通过突变实验证实，Lys1008 对病毒复制至关重要。
- 聚合酶激活的双靶点抑制：目前缺乏直接针对植物病毒的化学抗病毒化合物，研究人员用 TSWV 感染性克隆筛选了三种人类抗病毒药物，发现利巴韦林对 TSWV 复制有显著抑制作用。结构分析表明，利巴韦林可结合到聚合酶的活性位点和 RNA 结合位点的关键通道，阻止 5′端进入钩状结合口袋，抑制聚合酶激活。此外，利巴韦林三磷酸酯也有类似的双靶点结合模式，能强烈抑制 TSWV 感染。
研究结论和讨论部分指出，TSWV L 蛋白结构揭示了植物病毒 RNA 聚合酶与动物病毒聚合酶的相似性，暗示了它们可能有共同的进化起源。同时，研究还发现了病毒启动子的新结构特征，提出了 L 蛋白激活和病毒复制的新模型。此外，研究首次发现了布尼亚病毒 L 蛋白中的新基序 I，为理解 sNSV 聚合酶的活性位点组成提供了新视角。更为重要的是，明确了利巴韦林及其三磷酸酯对 TSWV 聚合酶的双靶点抑制机制，为开发针对植物病毒的抗病毒农药提供了关键的理论基础。这一研究成果就像一把钥匙，为未来设计更有效的抗病毒策略、保障全球粮食安全打开了新的大门。
