乙肝病毒核心颗粒组装与 DNA 复制调控机制新发现：膜与前核心蛋白的关键作用

《mBio》：Effects of cellular membranes and the precore protein on hepatitis B virus core particle assembly and DNA replication

本文揭示乙肝病毒（HBV）核心颗粒在不同亚细胞区室的特征，以及膜和前核心蛋白对其组装和 DNA 复制的调控作用。

　　

乙肝病毒核心颗粒研究的重要意义

乙肝病毒（HBV）是一种严重危害人类健康的病原体，全球约有 2.54 亿人慢性感染，每年导致约 100 万人死亡。HBV 核心颗粒在病毒 DNA 基因组的运输和复制过程中起着关键作用，其主要组成蛋白为核心蛋白。深入研究 HBV 核心颗粒在不同亚细胞区室的特征，以及相关蛋白对其影响，对于理解 HBV 生命周期、开发新型治疗药物至关重要。

乙肝病毒的基本结构与生命周期

HBV 是一种嗜肝性包膜 DNA 病毒，其包膜由三种羧基末端糖蛋白组成，即表面抗原（HBsAg）。病毒核心主要包含核心蛋白和 DNA 基因组，基因组为部分双链环状分子，长度约 3.2kb，含有四个重叠基因，分别编码 HBsAg、核心蛋白、前核心蛋白、DNA 聚合酶和 X 蛋白（HBx）。

当 HBV 感染肝细胞后，核心颗粒将病毒基因组 DNA 运送至细胞核，DNA 随后被修复形成共价闭合环状 DNA（cccDNA）。cccDNA 指导病毒 RNA 的转录，其中 3.5kb 的 RNA 编码核心蛋白和病毒 DNA 聚合酶，同时作为合成 HBV 基因组 DNA 的模板，被称为前基因组 RNA（pgRNA）。pgRNA 在核心颗粒中经病毒 DNA 聚合酶（也是逆转录酶）作用，先逆转录为负链 DNA，再合成正链，形成松弛环状 DNA（rcDNA）基因组，完成病毒复制过程。

实验设计与方法

1. 细胞培养与 DNA 构建：选用 Huh7 细胞（人肝癌细胞系）和 HepAD38 细胞（源自 HepG2 细胞，含整合 HBV 基因组 DNA）进行实验。构建多种质粒，包括携带 1.3mer 超长野生型 HBV 基因组（WT-HBV）的质粒、前核心突变体（PCMT，无法表达前核心蛋白）的质粒，以及单独表达核心蛋白、前核心蛋白或前核心蛋白无信号肽形式（p22）的质粒。
2. 转染与药物处理：采用 Lipofectamine 3000 进行 DNA 转染，根据实验需求设置不同转染组合。使用 bafilomycin A1（BafA1，自噬降解抑制剂）和 MG132（蛋白酶体抑制剂）处理细胞，观察对相关蛋白水平的影响。
3. 检测方法：运用免疫印迹分析、酶联免疫吸附测定（ELISA）、非变性琼脂糖凝胶电泳（NAGE）、Southern blot、Northern blot 等技术，检测蛋白表达、病毒抗原、核心颗粒结构、病毒 RNA 和 DNA 等。通过亚细胞分级分离技术，获取细胞质、细胞核、膜和胞质溶胶等不同亚细胞组分进行分析。

乙肝病毒核心颗粒在细胞核和细胞质中的特征

1. 核心颗粒结构差异：转染不同质粒后，分离细胞的细胞质和细胞核组分。结果显示，核心蛋白主要存在于细胞质中，而前核心蛋白衍生物（如 p22）在细胞核中也有显著量的存在。单独表达核心蛋白时，在细胞质和细胞核中形成的核心颗粒在非变性琼脂糖凝胶上迁移为一条带，且迁移速度略慢于酵母来源的核心颗粒。转染 WT-HBV 或 PCMT 后，除了快速迁移的核心颗粒带，还出现了迁移速度较慢的条带，且 WT-HBV 转染细胞的细胞质中该条带更明显，可能代表由前核心蛋白和核心蛋白组成的嵌合颗粒。
2. 与 RNA 的关系：对细胞质和细胞核组分进行 RNase 处理后发现，部分核心颗粒信号减弱，且这些颗粒经 Northern blot 分析无法被 HBV 反义核糖探针检测到，表明它们是空颗粒或由细胞 RNA 松散结合的颗粒。而快速迁移的核心颗粒对 RNase 有抗性，且能被反义 HBV 核糖探针检测到，说明其含有 HBV pgRNA。
3. 核心颗粒与细胞系及基因型的关系：在 HepAD38 细胞中进行类似分析，也检测到了快速迁移的核心颗粒带和较慢迁移的条带，且该细胞系中前核心蛋白信号较弱，这与之前报道一致，表明 HBV 核心颗粒的组装不受细胞类型和 HBV 基因型的影响。
4. 前核心蛋白形成的结构：单独表达前核心蛋白时，在细胞核中可形成与细胞 RNA 结合的颗粒状结构，经 RNase 处理后信号消失，被称为 “前核心颗粒”。同时，Southern blot 分析显示，细胞核中核心颗粒相关的 HBV DNA 含量虽少但可检测到，且 PCMT 转染细胞产生的 HBV DNA 水平略高于 WT-HBV 转染细胞，表明前核心蛋白及其衍生物可抑制 HBV 核衣壳组装和 DNA 复制。

与膜相关及胞质溶胶中乙肝病毒核心颗粒的特征

1. 膜与核心颗粒的关系：通过膜浮选实验，利用不连续蔗糖梯度将细胞质分离为膜和胞质溶胶组分。结果发现，脂质化的 LC3（LC3-II）、CD63 和 GM130 等膜标记蛋白主要存在于膜组分（蔗糖梯度第 4 层），而非脂质化的 LC3（LC3-I）和甘油醛 - 3 - 磷酸脱氢酶（GAPDH）等胞质蛋白主要存在于胞质溶胶组分（第 8 - 11 层）。前核心蛋白衍生物仅存在于膜组分，核心蛋白在膜和胞质溶胶中均有分布。
2. 核心颗粒结构差异：对各组分核心颗粒分析发现，胞质溶胶中的核心颗粒迁移速度均匀，而膜相关的核心颗粒信号较弱且迁移速度不均一，可分为迁移速度快于和慢于胞质溶胶核心颗粒的两组，表明膜相关核心颗粒结构与胞质溶胶中的不同。

前核心蛋白对核心颗粒结构的影响

1. 不同转染条件下核心颗粒结构比较：转染不同质粒后，对细胞质膜和胞质溶胶组分的核心颗粒进行分析。结果显示，PCMT 转染细胞的胞质溶胶核心颗粒在凝胶上迁移为一条主要条带，膜相关核心颗粒较少且迁移速度不均一；核心蛋白表达质粒转染细胞的胞质溶胶核心颗粒迁移均匀，膜相关核心颗粒信号微弱；前核心蛋白单独表达时，在胞质溶胶中无明显信号，在膜组分中出现迁移速度明显降低的信号，表明前核心蛋白与膜结合时可形成显示 HBcAg 抗原决定簇的颗粒结构。
2. 前核心蛋白对核心颗粒迁移速度的影响：比较不同转染条件下核心颗粒的迁移速度发现，WT-HBV 转染细胞的胞质溶胶核心颗粒迁移速度比 PCMT 转染细胞的慢，PCMT 转染细胞的又比单独表达核心蛋白时慢，说明前核心蛋白的存在影响核心颗粒结构，可能形成嵌合颗粒。在膜相关核心颗粒中，WT-HBV 样本产生的信号更不均一，且有迁移速度明显降低的弥散信号，可能代表前核心蛋白比例增加的嵌合颗粒。
3. 前核心蛋白对核心蛋白与膜结合的影响：免疫印迹分析表明，从 1.3mer 基因组表达的核心蛋白与膜的结合效率更高，且前核心蛋白的存在可增强核心蛋白与膜的结合，可能是因为参与形成嵌合颗粒。同时，RNase 处理显示，快速迁移的核心颗粒对 RNase 有抗性且含有 pgRNA，膜相关核心颗粒中的 pgRNA 部分对 RNase 敏感，说明部分未完全包装；较慢迁移的核心颗粒部分对 RNase 敏感且不含 HBV RNA，由空颗粒和与细胞 RNA 结合稳定的颗粒组成。

前核心蛋白在反式互补实验中对核心颗粒组装的影响

1. 反式互补实验设计：共转染 Huh7 细胞 PCMT 和不同量的前核心蛋白表达质粒，以 WT-HBV 转染细胞为对照，进行亚细胞分级分离实验，分析核心颗粒和相关蛋白表达。
2. 实验结果：在细胞质中，随着前核心蛋白表达质粒量的增加，出现了与 WT-HBV 转染细胞中主要核心颗粒带共迁移的颗粒结构；进一步分离细胞质为胞质溶胶和膜组分后，发现前核心蛋白在胞质溶胶和膜中均使核心颗粒带上移，表明前核心蛋白和核心蛋白可在胞质溶胶和膜相关区域形成嵌合颗粒。在细胞核中，共转染前核心质粒与 PCMT 未改变核心颗粒的迁移速度，但出现了与前核心蛋白单独产生的前核心颗粒共迁移的条带，说明前核心蛋白衍生物在细胞核中可能优先形成前核心颗粒，而不与核心蛋白相互作用。

膜对乙肝病毒正链 DNA 合成的促进作用

1. 核心颗粒中 HBV DNA 的特征：对不同蔗糖梯度组分核心颗粒中的 HBV DNA 进行 Southern blot 分析，发现胞质溶胶组分（第 8 - 11 层）中的核心颗粒主要含有单链 DNA（ssDNA），而膜组分中的核心颗粒含有更成熟的 rcDNA。在 WT-HBV 和 PCMT 转染细胞以及 HepAD38 细胞中均得到类似结果，表明膜可促进 HBV 正链 DNA 合成。
2. 前核心蛋白对 HBV DNA 复制的影响：比较 WT-HBV 和 PCMT 转染细胞核心颗粒相关的 HBV DNA 水平，发现 PCMT 转染细胞的胞质溶胶和膜组分中 HBV DNA 水平略高于 WT-HBV 转染细胞，说明前核心蛋白对 HBV DNA 复制有负面影响。共表达 p22 和 PCMT 的反式互补实验显示，p22 可剂量依赖性地降低胞质溶胶中的 ssDNA 水平，减少膜组分中的 rcDNA 水平，表明 p22 可抑制胞质溶胶中 HBV DNA 第一链合成和膜相关核心颗粒中第二链合成。
3. 核心颗粒与 HBV DNA 的关联：对经颗粒凝胶分离的核心颗粒进行 Southern blot 分析，发现只有快速迁移的核心颗粒含有 HBV DNA，且膜相关核心颗粒的 DNA 信号在凝胶上迁移速度略慢于胞质溶胶中的，这可能与它们的 DNA 组成差异有关，膜相关核心颗粒含 rcDNA，胞质溶胶核心颗粒主要含 ssDNA。

抑制自噬降解对前核心蛋白水平的影响

1. 自噬抑制剂对蛋白水平的影响：用 BafA1（自噬降解抑制剂）和 MG132（蛋白酶体抑制剂）处理转染不同质粒的 Huh7 细胞，免疫印迹分析显示，BafA1 可增加 WT-HBV、前核心蛋白表达质粒和 p22 表达质粒表达的前核心蛋白衍生物水平，同时降低核心蛋白和 HBsAg 水平；而 MG132 未增加前核心蛋白水平，反而降低了 WT-HBV 表达的前核心蛋白水平，对核心蛋白水平也有轻微降低作用，但不影响 HBsAg 水平。
2. 自噬对前核心蛋白调控的意义：该结果表明自噬参与前核心蛋白衍生物的降解，且这种降解不依赖前核心蛋白进入内质网腔，因为无信号肽的 p22 也可被 BafA1 增加水平。这一发现提示自噬可能在调节前核心蛋白生物学活性中发挥作用，鉴于胞质前核心蛋白衍生物可抑制 HBV DNA 复制，推测 HBV 可能利用自噬降低胞质前核心蛋白衍生物水平以增强自身复制，或者利用 p22 和自噬降解去除 toll - 样受体 2（TLR2）。

研究结论与展望

本研究详细分析了 HBV 核心颗粒在不同亚细胞区室的特征，明确了前核心蛋白对核心颗粒结构和组装的影响，以及膜和前核心蛋白对 HBV DNA 复制的调控作用。同时发现自噬可调节前核心蛋白水平，为深入理解 HBV 生命周期提供了重要依据。然而，仍有许多问题有待进一步研究，如核心蛋白和前核心蛋白与细胞 RNA 结合的具体机制和生物学意义，前核心蛋白在细胞核中优先形成前核心颗粒的原因，以及自噬调节前核心蛋白活性的详细分子机制等。这些研究将为开发针对 HBV 感染的新型治疗策略提供更坚实的理论基础。