疟原虫 LINC 复合物关键组分的探索：PfSUN1 和 PfSUN2 的功能解析

《mBio》：SUN-domain proteins of the malaria parasite Plasmodium falciparum are essential for proper nuclear division and DNA repair

本文发现疟原虫（Plasmodium）LINC 复合物的两个关键蛋白 PfSUN1 和 PfSUN2，它们对疟原虫增殖等至关重要。

　　

疟原虫研究背景

疟疾是一种由疟原虫属（Plasmodium）原生动物寄生虫引起的全球性公共卫生问题，每年感染人数超 2 亿，死亡人数超 60 万。其中，恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）导致的疟疾最为致命，主要威胁儿童和孕妇。目前，疟疾缺乏有效疫苗，疟原虫还对多种抗疟药物产生耐药性，给防控带来巨大挑战。

疟原虫的生命周期复杂，在不同宿主和环境中经历独特的复制周期和形态变化，这依赖于细胞周期相关基因表达的严格调控。在这个过程中，疟原虫细胞核与细胞质之间的物质交换和信号传递十分关键，而核膜（NE）不仅作为两者的物理分隔，还参与调控核内和细胞过程，在信号转导中发挥重要作用。

在真核生物中，连接核骨架和细胞骨架的 LINC（linker of nucleoskeleton and cytoskeleton）复合物至关重要。它跨越核膜，形成细胞核与细胞质之间的直接机械连接，参与核定位、迁移、定向、细胞分裂、DNA 修复和染色体组织等过程。然而，对于疟原虫核膜的组成成分，人们知之甚少，疟原虫缺乏常规的核纤层蛋白，其核膜下核支架的构成因素尚不明确。关于疟原虫或其他顶复门寄生虫中 LINC 复合物的组成，也仅有少量研究。近期研究发现伯氏疟原虫（Plasmodium berghei）存在一种类似 LINC 的复合物，由 SUN1 和 ALLC1 组成，在雄性配子发生和疟疾传播中起重要作用。但疟原虫 LINC 复合物的具体功能和机制仍有待深入探索。

疟原虫中假定的 SUN 结构域蛋白

研究人员通过在疟原虫数据库（PlasmoDB）中进行 BLAST 搜索，利用人类同源物的氨基酸序列，鉴定出两个含有 SUN 结构域的假定蛋白，命名为 PfSUN1（PF3D7_1215100）和 PfSUN2（PF3D7_1439300）。序列分析显示，PfSUN1 的 SUN 结构域与人类 HsSUN2 和 5 的相似性和结构保守性较高，而 PfSUN2 的 SUN 结构域与拟南芥（Arabidopsis thaliana）的更为相似。这两种蛋白在疟原虫物种中都具有保守性，且都包含跨膜（TM）结构域、卷曲螺旋（CC）结构域和 SUN 结构域，暗示它们可能作为 LINC 复合物的组成部分发挥作用。

PfSUN1 是一种核膜蛋白

转录组数据分析表明，PfSUN1 和 PfSUN2 在疟原虫的整个生命周期中均有转录，且转录水平存在阶段特异性变化。为了深入研究 PfSUN1 的特性，研究人员异位表达了 PfSUN1-GFP 融合蛋白，并在疟原虫的红细胞内发育周期（IDC）中追踪其细胞定位。结果发现，PfSUN1-GFP 在整个 IDC 过程中都围绕着细胞核周边的 DNA 染色区域，暗示其可能定位于核膜。免疫电镜实验进一步证实了 PfSUN1-GFP 位于核膜。

研究人员利用直接随机光学重建显微镜（dSTORM）成像技术，以核孔蛋白 PfSec13 为标记，研究 PfSUN1 与核孔复合体（NPC）的关系。结果显示，PfSUN1 和 PfSec13 在 IDC 过程中都围绕着核周边，但 PfSUN1 的分布模式更为连续，且在一些区域有较强的信号焦点，这些焦点常常与 NPC 相邻。在晚期裂殖体中，PfSUN1 在与 NPC 簇相同的核极处有明显积累。此外，研究还发现 PfSUN1 不与异染色质标记 H3K9me3 或常染色质标记 H3K9ac 共定位。

通过对 PfSUN1 的卷曲螺旋结构域和 SUN 结构域进行缺失分析，研究人员发现删除卷曲螺旋结构域以及同时删除卷曲螺旋和 SUN 结构域，即使跨膜结构域未被删除，也会导致 PfSUN1 无法定位到核膜，这表明卷曲螺旋结构域对 PfSUN1 在核膜的正确定位至关重要。

为了更深入地研究 PfSUN1 和 PfSUN2 的功能，研究人员利用 pSLI 系统创建了转基因疟原虫系，使 PfSUN1 或 PfSUN2 内源性地标记血凝素（HA）表位，并与glmS核酶融合，通过在培养基中添加葡萄糖胺（GlcN）实现条件性敲低。免疫荧光分析（IFA）和 dSTORM 成像结果表明，内源性标记的 PfSUN1 和 PfSUN2 均定位于核周边，且 PfSUN2 与核周边的异染色质标记 H3K9me3 存在共定位现象。实验还发现，使用 5 mM GlcN 可下调 PfSUN1 和 PfSUN2 的表达，导致培养的疟原虫群体增殖率下降，每个裂殖体的细胞核数量减少，异常核分裂的寄生虫数量增加，这充分证明了 PfSUN1 和 PfSUN2 是核膜蛋白，对恶性疟原虫的正常增殖至关重要。

PfSUN1 和 PfSUN2 缺失导致寄生虫形态改变

SUN 结构域蛋白在维持核结构方面起着重要作用。研究人员推测，PfSUN1 和 PfSUN2 表达敲低导致的疟原虫群体生长速率降低，可能意味着部分寄生虫无法正常进行核分裂和产生有活力的子代裂殖子。通过透射电子显微镜（TEM）对寄生虫复制过程中的超微结构变化进行评估，研究人员发现，在许多（但并非全部）PfSUN1 和 PfSUN2 表达下调的寄生虫中，裂殖体在发育过程中出现显著的形态变形和内部结构丧失，同时还观察到大量电子致密的膜结合液泡结构，这可能代表了寄生虫的一种凋亡样表型，表明这些寄生虫无法完成红细胞内的发育。这一结果表明，疟原虫中的 SUN 结构域蛋白在裂殖体阶段的核分裂和细胞分裂为子代裂殖子的过程中发挥着重要作用。

作为 LINC 复合物的一部分，SUN 结构域蛋白可能作为支架维持核膜的内外膜结构。研究人员利用 TEM 对紧密同步的滋养体进行观察，发现 PfSUN2 表达敲低的寄生虫核膜出现许多变形，其核内膜与外膜之间的平均距离显著增宽；而 PfSUN1 敲低的寄生虫核膜形态看似正常，但细胞核的圆形度显著降低。此外，在 PfSUN1 和 PfSUN2 敲低的寄生虫中，均观察到核膜的重复现象，以及同心层状膜性涡旋的形成，这些膜性涡旋涉及核内膜和外膜，且在细胞质或食物泡（FV）中也有发现。与野生型 NF54 寄生虫相比，PfSUN1 敲低的寄生虫中膜性涡旋的出现更为频繁，这表明 PfSUN1 和 PfSUN2 在维持核膜的正常形态和结构方面具有重要作用。

PfSUN1 对激活 DNA 损伤反应至关重要

此前在哺乳动物细胞中的研究表明，小鼠的 SUN 结构域蛋白 SUN1 和 SUN2 在 DNA 损伤反应（DDR）中发挥重要作用。疟原虫在连续的有丝分裂周期中多次复制其单倍体基因组，在 DNA 复制过程中特别容易出错，因此研究人员探究了 PfSUN1 和 PfSUN2 在恶性疟原虫 DDR 中的作用。

研究人员应用了一种针对疟原虫优化的 DDR 检测方法，利用抗 γ-H2A.X 抗体识别磷酸化的 PfH2A，以此作为恶性疟原虫 DNA 损伤的标记。对转基因系 PfSUN1-HA-glmS和 PfSUN2-HA-glmS进行亚致死剂量的 X 射线照射，并在有无 PfSUN1 表达的情况下追踪 PfH2A 的磷酸化动力学。结果发现，在未添加 GlcN 的情况下，PfSUN1-HA-glmS寄生虫在照射后 4 小时内，PfH2A 的磷酸化水平下降，表明 DNA 损伤得到修复；而在添加 GlcN 抑制 PfSUN1 表达后，寄生虫无法修复 DNA 损伤，PfH2A 的磷酸化水平在照射后保持恒定。然而，GlcN 对 NF54 野生型寄生虫激活 DDR 的能力没有影响，且研究人员未检测到 PfSUN2 在 DNA 损伤修复过程中的明显差异。这一结果表明，PfSUN1 对恶性疟原虫激活 DDR 至关重要。

讨论

疟原虫独特的生物学特性，尤其是其在裂殖体阶段通过封闭有丝分裂进行复制的方式，对其核结构和功能提出了特殊要求。疟原虫的核周边区域与基因表达调控密切相关，特别是与毒力和免疫逃避相关的基因，但由于核膜成分的研究有限，对这一亚核区域的精确形态学特征仍知之甚少。尽管 LINC 复合物在核功能中具有重要作用，但在疟原虫中的研究相对较少。在缺乏常规核纤层蛋白的疟原虫中，LINC 复合物如何介导核动力学过程仍是一个未解之谜。

研究发现的 PfSUN1 和 PfSUN2 对血期疟原虫的正常增殖至关重要，且它们在 IDC 过程中的转录模式存在差异，这暗示它们在疟原虫生命周期的其他阶段可能也具有重要功能。此前对疟原虫生育基因的筛选表明，伯氏疟原虫 SUN1 复合物在雄性配子发生过程中对纺锤体形成至关重要，这与 PfSUN1 在恶性疟原虫无性裂殖体阶段的极性定位相呼应，表明在顶复门寄生虫中可能存在保守的核 - 细胞骨架相互作用机制。

PfSUN1 和 PfSUN2 在寄生虫增殖过程中具有不同的功能，PfSUN2 与异染色质的关联更为紧密，而 PfSUN1 在 DNA 损伤修复中发挥特定作用。在疟原虫裂殖体阶段，核孔复合体（NPC）的动态变化与 PfSUN1 和 PfSUN2 的定位极性相关，这强烈表明 PfSUN 蛋白在核分裂和细胞分裂过程中发挥着重要作用。此外，PfSUN1 和 PfSUN2 敲低后出现的膜性涡旋现象，可能与酵母中的微自噬过程类似，暗示 SUN 蛋白在维持核膜和内质网（ER）的稳态方面具有重要作用。

PfSUN1 在激活 DDR 中的关键作用，进一步强调了 LINC 复合物在疟原虫 DNA 损伤修复过程中的重要性。在其他生物中，SUN 结构域蛋白参与 DNA 修复蛋白的招募和损伤位点的定位，虽然疟原虫中 LINC 复合物在 DDR 中的具体机制尚不清楚，但推测 PfSUN 蛋白可能有助于在核周边形成功能性修复位点，并促进损伤位点和修复机制的结合。

本研究首次揭示了 SUN 蛋白作为疟原虫 LINC 复合物可能组成部分的重要作用，为进一步研究疟原虫核功能提供了新的视角。未来，对 PfSUN 蛋白的深入研究有望揭示疟原虫 LINC 复合物的更多组成成分和功能机制，为开发新型抗疟药物提供潜在的靶点。