双向孟德尔随机化分析揭示 Ephrin-B2（EFNB2）与癫痫之间的因果关系

本文通过双向孟德尔随机化（MR）分析，发现血清 EFNB2 水平与癫痫存在因果关系，为癫痫研究提供新方向。

　　

癫痫与 EFNB2 研究背景

癫痫是一种严重的神经系统疾病，持续发作是其主要特征，部分患者还会伴有神经生物学、认知以及心理社会方面的不良后果。神经元信号传导异常、神经网络形成障碍以及遗传因素都与癫痫的发生密切相关 。目前，癫痫的发病机制尚未完全明确，给临床治疗带来了很大挑战。

Ephrin-B2（EFNB2）基因编码 Ephrin 家族蛋白成员，该蛋白是一种细胞表面蛋白，在细胞信号传导和组织构建中发挥着重要作用。在生理过程方面，EFNB2 参与血管生成、神经元发育以及组织边界的形成。在癌症领域，EFNB2 高表达与结直肠癌、乳腺癌等肿瘤的侵袭性进展有关。在神经系统疾病范畴，鉴于其在神经元连接和可塑性方面的作用，EFNB2 在癫痫研究中备受关注。不过，EFNB2 与癫痫之间的关系尚不明确，它究竟是直接促使癫痫发生，还是仅仅作为疾病伴随的遗传变异存在，仍有待探究。由于 EFNB2 参与 mTOR、MAPK/ERK 等与癫痫发生相关的信号通路，对其在癫痫发病机制中的作用进行研究意义重大，有望为癫痫治疗提供新的靶点。

孟德尔随机化（MR）是一种创新的基因组学研究方法，它利用遗传变异作为工具变量，借助基于人群的观察性研究数据来确定暴露因素与结局之间的因果关系。在神经精神病学研究中，MR 能够有效判断关联的方向性，相较于仅评估两种表型且无法测试双向关系的潜在因果变量分析更具优势。此外，多变量孟德尔随机化（MVMR）还能同时评估多个暴露因素，有助于明确复杂关系，控制潜在的中介或混杂因素影响。本研究采用双向 MR 分析，旨在探究 EFNB2 基因表达与癫痫发病之间的潜在因果联系。

研究方法

1. 数据来源：研究数据主要来源于 GWAS_Catalog 数据库和 Finngen 数据库。在暴露数据选取上，从 GWAS_Catalog 数据库获取欧洲人群（EUR）血清 EFNB2 水平的全基因组关联研究（GWAS）汇总数据，涉及 5365 个样本，检测到 7492219 个单核苷酸多态性（SNP） 。结局数据则取自 Finngen 数据库中 EUR 人群的全身性癫痫 GWAS 汇总数据，包含 366832 个样本，检测到 20170015 个 SNP。为进行验证，选取 GWAS_Catalog 数据库中另一组 EUR 人群血清 EFNB2 水平数据（5361 个样本，7492219 个 SNP）作为暴露数据，从 IEU 数据库选取 EUR 人群自我报告的癫痫（非癌症疾病代码）GWAS 汇总数据（462933 个样本，4455394 个 SNP）作为结局数据。
2. 工具变量选择：为确保工具变量有效，需满足三个关键假设。一是相关性假设，即遗传变异要与暴露因素紧密相关；二是独立性假设，遗传变异不能与可能的混杂因素存在关联；三是排他性假设，遗传变异只能通过暴露因素影响结局，不能直接与结局相关。基于这些假设，研究设定了严格筛选标准。选择全基因组显著性水平 p 值 < 5e^-6、F 统计量≥10 的 SNP，以保证工具变量与暴露因素的强相关性，同时通过额外的敏感性分析控制潜在假阳性风险。利用 r²为 0.001、遗传距离为 10000 kb 的参数设置进行连锁不平衡分析，去除高度相关变量，保证变量独立性，并剔除回文 SNP（如 A/T 或 G/C 等位基因），确保 SNP 对暴露和结局的影响方向一致。
3. 孟德尔随机化分析：运用逆方差加权（IVW）、MR-Egger、加权中位数、简单模式和加权模式等方法开展两样本 MR 分析，其中以 IVW 方法为主，其他四种方法作为补充，用于评估暴露因素对结局数据的影响。
4. 敏感性分析：采用多种统计方法进行敏感性分析。通过 MR 多效性残差和离群值（MR-PRESSO）检验以及 MR-Egger 截距法检测水平多效性，利用 Cochran’s Q 检验分析各工具变量间的异质性，并根据异质性程度选择固定效应模型或随机效应模型进行后续分析。此外，进行留一法分析，每次迭代剔除一个不同的 SNP 进行 MR 分析，以判断暴露因素与结局之间的显著关联是否受单个 SNP 主导。这些分析均借助 R 包 TwoSampleMR 在 RStudio 2023.12.1 软件中完成。
5. 共定位分析：在确定暴露因素与结局之间的因果关系后，以孟德尔分析中筛选出的工具变量作为先导 SNP，对其上下游 500 kb 范围内的 SNP 进行共定位分析，以 0.75 为阈值判断基因水平是否存在多效性，该分析使用 R 包 coloc 完成。

研究结果

1. 工具变量选择结果：经过严格筛选，在初始研究队列中，从与暴露因素显著相关的 27 个 SNP 中，最终确定了 8 个相互独立且 F 值大于 10 的工具变量。在验证队列中，从 97 个与暴露因素显著相关的 SNP 里筛选出 18 个符合条件的工具变量，这些工具变量均可用于后续的因果推断分析。
2. 孟德尔随机化分析结果：在初始研究队列中，IVW 模型分析显示，暴露因素与结局指标之间存在显著因果关系（OR = 0.6552，95% CI = 0.4642 - 0.9249，p 值 = 0.0162），表明血清 EFNB2 水平每增加一个标准差，癫痫发病几率约降低 34.5% 。敏感性分析结果显示，MR-PRESSO 和 MR-Egger 截距检验均未发现多效性，Cochran’s Q 检验表明不存在异质性，留一法分析表明整体关系估计不受单个 SNP 显著影响。在验证队列中，IVW 模型同样显示暴露因素与结局指标存在统计学显著的因果关系（OR = 0.9984，95% CI = 0.9971 - 0.9996，p 值 = 0.0126），但因果效应较初始队列弱，这可能是由于验证队列采用自我报告的癫痫诊断数据，存在回忆偏倚，且样本量较大、表型定义更宽泛所致。
3. 共定位分析结果：在初始队列和验证队列中，以 0.75 为阈值进行共定位分析，结果均为阴性，即暴露与结局之间缺乏共定位证据，这意味着两者之间的遗传影响途径可能不重叠，因果关系可能并非通过共同遗传途径实现，而是涉及其他生物学机制或环境因素。
4. 反向孟德尔分析结果：进行反向 MR 分析时，交换结局与暴露因素后，IVW 模型结果显示暴露因素与结局指标之间不存在显著因果关系，表明癫痫不会引起血清 EFNB2 浓度变化。

研究讨论

本研究首次直接证实了 EFNB2 与癫痫之间的因果关系。在研究队列中，血清 EFNB2 水平降低可能导致癫痫发生，而反向 MR 研究表明癫痫不会影响血清 EFNB2 浓度。不过，验证队列中虽然也证实了两者的因果关系，但效应较弱，可能是由于队列选取差异和自我报告数据的局限性导致。共定位分析发现 EFNB2 相关 SNP 与癫痫相关 SNP 不存在共享因果遗传变异，进一步支持了两者间因果关系的复杂性。

目前，关于 EFNB2 的研究主要集中在血管生成和肿瘤发展方面，在神经系统疾病研究中，EFNB2 参与海马神经发生、神经嵴细胞迁移和突触可塑性等过程，这些过程与癫痫密切相关。EFNB2 可能通过调节 mTOR 和 MAPK/ERK 等信号通路影响癫痫发病，不过具体生物学机制尚不明确。另外，癫痫患者常出现认知障碍和记忆减退，与突触可塑性下降有关，鉴于 EFNB2 与突触可塑性的关联，其在癫痫相关神经退行性变化方面的作用值得深入研究，虽然其在癫痫发病中的具体作用复杂，但可能在改善癫痫患者认知功能方面具有潜在意义。

本研究存在一定局限性。研究队列仅包含欧洲血统人群，限制了研究结果的普适性，未来需在更多样化人群中验证。研究以血清 EFNB2 浓度代替其在体内的作用，无法评估脑脊液（CSF）中浓度，而 CSF 中的浓度与中枢神经系统更直接相关，后续研究应补充这方面数据。孟德尔随机化虽能推断统计因果关系，但不能确定生物学因果关系，缺乏实验室功能研究限制了对研究结果的解释，需借助体外神经元细胞系研究或体内动物模型实验进一步探索。癫痫具有异质性，本研究主要针对全身性癫痫，未涉及其他类型癫痫，未来应研究 EFNB2 在不同癫痫亚型中的作用差异。验证队列依赖自我报告数据，存在回忆偏倚，且共定位分析结果提示两者关系可能涉及间接遗传途径或环境因素，后续研究可整合多组学方法，探索非遗传因素，以更全面地了解 EFNB2 与癫痫之间的关系。

研究结论

本研究通过严谨的双向孟德尔随机化方法，明确了血清 EFNB2 水平与癫痫发展之间存在显著因果关系，凸显了 EFNB2 基因在神经系统疾病尤其是癫痫中的重要作用，为癫痫治疗靶点研究提供了新方向。然而，EFNB2 与癫痫之间的潜在机制仍需进一步深入研究，未来需开展更多实验和更广泛的人群研究，以推动癫痫研究和治疗的发展。