基于酯键的肽标记系统 ReverseTag/ReverseCatcher 的理性设计及其在酶活性调控中的应用

本文理性设计了 ReverseTag/ReverseCatcher 系统，可高效形成酯键，通过 T11S 突变加速水解，调控外切菊粉酶（EXINU）活性。

　　

一、引言

在革兰氏阳性菌的菌毛粘附蛋白中，存在着一类独特的结构域，其内部含有硫酯键、异肽键和酯键等特殊的分子内共价键。这些共价键赋予了蛋白质特殊的性能，使其能够牢固地附着在表面或抵抗较大的机械扰动。基于这些结构域的独特性质，研究人员开发出了多种肽标记系统，其中最著名的是 SpyTag/SpyCatcher 系统，它能在体外自发形成异肽键。此外，还有 SnoopTag/SnoopCatcher 系统等。然而，这些标记系统形成的共价键大多不可逆，限制了它们的广泛应用。

产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）的 Cpe0147 蛋白的 C1 结构域中存在一个由 Thr11 和 Gln141 形成的酯键。此前，Young 等人将 C1 结构域成功分割为截短蛋白 Cpe0147^{439 - 563}和肽 Cpe0147^{565 - 587}，构建了一个能在体外自发形成酯键的肽标记系统，且该酯键在碱性条件下可水解。为了拓展基于酯键的肽标记系统的应用，研究人员在 Cpe0147^{439 - 563}/Cpe0147^{565 - 587}的基础上，理性设计了一个增强型肽标记系统 ——ReverseTag/ReverseCatcher。该系统的酯键可反复形成和水解，并且通过在 ReverseCatcher 中引入 T11S 突变，提高了酯键的水解效率。这一调控系统还被应用于通过酯键的形成和水解来控制外切菊粉酶（exo - inulinase，EXINU）的活性，为利用肽标记系统调节蛋白质活性提供了新方法，也为多酶催化和蛋白质热稳定性等领域提供了新思路。

二、结果与讨论

（一）基于酯键的肽标记系统的构建

Cpe0147 的 C1 结构域具有独特的拓扑结构，包含一个单螺旋、七个 β 链和七个环，其中由 Thr11 和 Gln141 形成的酯键是本研究的关键元素。研究人员将 C1 结构域分割为 EBCatcher（Cpe0147^{439 - 563} ）和 EBTag（Cpe0147^{565 - 587} ），并在二者的 C 末端融合绿色荧光蛋白（GFP），以便更清晰地观察和分析。实验发现，在体外 EBTag_GFP 和 EBCatcher_GFP 能自发形成酯键，而当 Thr11 或 Gln141 突变为 Ala 时，酯键无法形成。

通过量子力学 / 分子力学（QM/MM）模拟，研究人员揭示了酯键形成的机制。酯键形成过程涉及三个过渡态（TSs）和两个中间态（IMs），是一个热力学有利的过程，反应自由能为 - 32.5 kJ/mol。具体过程为，Thr11 的 - OH 基团向催化碱基提供一个质子，随后 Thr11 的 Oγ1 原子作为亲核试剂攻击 Gln141 的侧链，接着 Gln141 的 - NH₂基团从 His133 获得一个质子，释放出一个 NH₃分子，从而形成 Thr11 和 Gln141 之间的酯键。此外，研究还发现 His133 是促进酯键形成的催化残基，Asp41 与 Gln141 的羰基以及 Glu108 与 Asp41 之间的氢键相互作用有助于维持系统的稳定性，当这些残基突变为 Ala 时，突变体均失去了与亲本 Tag 或 Catcher 形成酯键的活性。

（二）理性设计获得 ReverseTag/ReverseCatcher

为了加速酯键的形成，研究人员对 EBCatcher 进行改造，引入 F30Y、A50P、N109R 和 N115D 四个特定突变，开发出 ReverseCatcher。同时，在 EBTag 的 C 末端添加 Asn（N）和 Arg（R）残基，得到 ReverseTag。F30Y 突变增强了 Phe30 与周围水分子的相互作用，稳定了钙离子结合位点；A50P 突变提高了局部结构的稳定性；N109R 和 N115D 突变则通过形成盐桥优化了 Catcher - Tag 的相互作用。受在 SpyTag 的 N 末端引入 Arg 可增强其与 NGCatcher 相互作用的启发，研究人员在 EBTag 的 C 末端添加 Arg 并与 Asn 结合，形成 ReverseTag。这些理性设计使得酯键的偶联效率从 EBTag/EBCatcher 复合物的 48% 显著提高到 ReverseTag/ReverseCatcher 的 88%。

（三）酯键形成效率提高的机制

为了探究 ReverseCatcher 相比 EBTag/EBCatcher 酯键形成效率提高的机制，研究人员进行了分子动力学（MD）模拟。F30Y 突变使 Tyr30 通过氢键与水分子相互作用，增加了溶剂可及表面积（SASA）；A50P 突变降低了 Catcher 中 K46 - N50 环的 backbone 柔性，尽管四个突变使 ReverseCatcher 的整体柔性增加，但 48 - 50 区域的残留柔性仍低于 EBCatcher，有效稳定了局部环境。N109R 和 N115D 突变促进了盐桥的形成，增强了 Tag 和 Catcher 之间的相互作用。伞形采样模拟和势能平均力（PMF）曲线表明，ReverseTag 和 ReverseCatcher 之间的相互作用更强，结合自由能（ΔG_bind）更低。添加 NR 二肽后，ReverseTag 的结构更稳定，更有利于与 ReverseCatcher 相互作用。

CD 数据显示，EBCatcher 和 ReverseCatcher 均呈无规卷曲结构，而当 Thr11 突变为 Ala 时，R1 结构域（ReverseTag/ReverseCatcher 复合物）的 β 折叠结构转变为无规卷曲构象，表明酯键介导了完全折叠结构的形成。MALDI - TOF - 质谱（MS）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）数据进一步证实了 ReverseTag_GFP/ReverseCatcher_GFP 复合物的成功形成以及酯键的存在。

（四）体外酯键形成条件的优化

研究人员对酯键形成的条件进行了优化。发现反应的最佳 pH 为 6.0，pH 高于 8.0 时，酯键虽能形成但会随时间水解。反应温度在 0°C - 100°C 范围内均可成功形成酯键，在 90°C 以下效率较高，100°C 时酯键仍能形成且半衰期约为 11 分钟，这得益于 ReverseTag 和 ReverseCatcher 的无规卷曲结构以及 ReverseTag 对温度变化的耐受性。在缓冲液条件方面，N - 2 - 羟乙基哌嗪 - N' - 2 - 乙磺酸（HEPES）是最有效的缓冲液类型，除 Ca^{2 +}外，Mn^{2 +}和 Co^{2 +}离子也能促进酯键形成，可能是因为它们可结合到 Catcher 的钙结合位点。此外，发现只有添加三甲胺 - N - 氧化物（TMAO）能显著提高酯键形成效率，这是因为 TMAO 可稳定 ReverseCatcher 的无序状态，增强其与 ReverseTag 的相互作用。

（五）二级速率常数显著提高

二级反应速率常数是评估肽标记系统效率的关键指标。在最佳反应条件下，通过 SDS - PAGE 分析发现，ReverseTag_GFP/ReverseCatcher_GFP 在 10 秒内即可形成约 70% 的酯键，而 EBTag_GFP/EBCatcher_GFP 仅形成约 10%。计算得出 ReverseTag_GFP/ReverseCatcher_GFP 的二级速率常数为 1.92 ± 0.002×10⁴ M ^{- 1} s ^{- 1}，是 EBTag_GFP/EBCatcher_GFP 标记系统（883 ± 18.3 M ^{- 1} s ^{- 1} ）的 21.7 倍。与 SpyTag/SpyCatcher 和 SpyTag002/SpyCatcher002 标记系统相比，ReverseTag_GFP/ReverseCatcher_GFP 的二级速率常数分别提高了 18.1 倍和 4.6 倍。ReverseTag_GFP/ReverseCatcher_GFP 和 EBTag_GFP/EBCatcher_GFP 结合物的半衰期分别为 5 秒和 111 秒，且当 ReverseTag_GFP 和 ReverseCatcher_GFP 的浓度分别为 5 μM 和 1 μM 时，酯键形成效率不受显著影响。

（六）R1 结构域中酯键的机械力

肽标记系统中分子内共价键的机械稳定性是影响其结构完整性和功能性能的关键因素。为了探究 ReverseTag 和 ReverseCatcher 之间相互作用的机械性能，研究人员构建了 R1 结构域（ReverseTag/ReverseCatcher 复合物）和工程化嵌合多聚蛋白 Fgβ - (GB1)₂ - R1 domain - (GB1)₂ - NGL、SdrG - ELP₈ - NGL，并通过原子力显微镜单分子力谱（AFM - SMFS）实验进行研究。实验中，多聚蛋白链被拉伸时，力 - 延伸曲线呈现出特征性的锯齿状模式，每个峰对应着多聚蛋白中单个结构域的展开。实验发现，即使 SdrG:Fgβ 相互作用被破坏，R1 结构域中的酯键仍能保持完整，可承受超过 2 nN 的力，其韧性与 C1 结构域相当。

（七）理性设计加速酯键水解

ReverseTag 和 ReverseCatcher 之间的酯键在碱性条件下形成后会随时间水解。研究发现，在 pH 9.0 时酯键轻微水解，pH 10.0 时显著水解，而脂肪酶无法水解该酯键。通过 QM/MM 模拟可知，酯键水解的反应自由能为 - 93.9 kJ/mol，水解势垒为 141.6 kJ/mol，表明酯键水解热力学上不利，形成后难以水解。其水解机制为：Asp41 先被水分子质子化形成氢氧根离子（OH ^- ），OH ^- 攻击酯键形成氧阴离子中间体，电子重排使 Thr11 的 Oγ1 转化为氧阴离子，与质子化的 Asp41 相互作用，最终质子从 Asp41 转移到 Thr11 的 Oγ1，导致酯键断裂，Gln141 转化为 Glu141，Asp41 恢复去质子化状态。

由于酯键水解需要高温和碱性条件，不适合实际应用中的大多数酶催化反应。为提高在更稳定环境中的水解效率，研究人员设计了 5 种 ReverseCatcher 突变体，其中 ReverseCatcher_T11S 突变体表现出显著优势，在保持 70% 酯键形成产率的同时，水解效率达到 40%。MALDI - TOF - MS 结果证实了 ReverseTag_GFP 和 ReverseCatcher_T11S_GFP 之间酯键的成功形成和水解。MD 模拟显示，R1 domain_T11S 中酯键周围的水分子分布比 R1 结构域更高，这可能通过稳定反应中间体和增强亲核攻击促进了水解。

（八）酯键可反复水解

研究人员进一步探究了水解后的酯键是否可以重新形成。将 ReverseTag_GFP/ReverseCatcher_T11S_GFP 复合物在 pH 10.0 条件下孵育使酯键完全水解，再将 pH 调至 6.0，发现酯键能够重新形成，尽管效率有所降低。在酯键重新形成过程中，Thr11 和 Glu141 通过去除一个 H₂O 分子实现了酯键的再生。这表明通过调节 pH 可以调节与 ReverseTag 和 ReverseCatcher_T11S 连接的靶蛋白的空间距离，这种 pH 依赖性的空间距离调节为理解动态蛋白质组装提供了新视角，在可逆生物传感器或分子机器的设计中具有潜在应用价值。

（九）通过酯键形成和水解调节 EXINU 活性

ReverseTag 和 ReverseCatcher_T11S 之间酯键的反复形成在两个蛋白质之间得到了证实，该系统有望应用于具有多个结构域的活性蛋白，通过调节 pH 精确调控其活性。研究人员利用双分子荧光互补（BiFC）系统评估酯键的形成和水解是否能控制分裂蛋白的活性。将黄色荧光蛋白（YFP）分为 YFP - N（残基 1 - 154）和 YFP - C（残基 155 - 238），分别与 ReverseCatcher_T11S 和 ReverseTag 融合。理论上，当 ReverseTag 与 ReverseCatcher_T11S 相互作用时，BiFC 复合物形成，在 514 nm 激发下会在 527 nm 处产生荧光信号。实验结果表明，YFP 的活性可通过酯键的形成和水解进行调节，且该过程可通过 pH 操作进行微调。

研究人员选择由碳水化合物识别结构域和催化结构域组成的 EXINU 来评估酶调控策略。在 EXINU 的 N 端（残基 1 - 339）和 C 端（残基 340 - 500）之间插入 R1 结构域，构建 EXINU - R1 domain，并进行 100 ns MD 模拟。结果显示，R1 结构域接近 EXINU，且插入 R1 结构域不影响 EXINU 的结构稳定性和酶活性。

为研究 ReverseTag 和 ReverseCatcher_T11S 能否通过调节 pH 来调控 EXINU 活性，研究人员设置了两个实验组。当 EXINU - C 和 EXINU - N 简单混合时无 EXINU 活性，而 EXINU - N_ReverseCatcher_T11S/ReverseTag_EXINU - C 复合物表现出较高活性，因此选择该组进行后续实验。研究发现，当 pH 从 10.0 降至 6.0 时，EXINU 活性消失，而复合物在 pH 恢复到 6.0 时能完全恢复 EXINU 活性。此外，还确定了复合物的最佳反应 pH 为 6.0，最佳反应温度从 EXINU 的 30°C 提高到 40°C，这可能是由于 R1 结构域与 EXINU 的稳定相互作用增强了复合物的热稳定性。

对 EXINU 和 EXINU - N_ReverseCatcher_T11S/ReverseTag_EXINU - C 复合物的酶动力学分析表明，复合物的 K_m值增加，表明其对底物的亲和力降低；V_{max - EXINU}/V_{max - EXINU - N_ReverseCatcher_T11S/ReverseTag_EXINU - C}比值为 69%，表明酶活性与酯键形成效率正相关；二者的 k_cat值相同，说明复合物的催化效率不受键形成过程的影响。

研究人员还评估了酯键的可重复使用性，发现随着水解循环次数的增加，酯键的结合效率逐渐降低，到第五次循环时显著下降，催化效率也随之降低，第五次循环时降至原始值的 10%。与 EXINU 相比，YFP 的重新激活能力较弱，这是因为 YFP 是单结构域蛋白，分裂后重新激活的条件更为苛刻，而 EXINU 包含两个结构域，要求相对较低，因此该策略可能更适用于多结构域蛋白。

三、方法

（一）酶的表达和纯化

本研究中使用的蛋白质在大肠杆菌 BL21 (DE3) 中表达。细胞在 37°C、200 rpm 的溶原肉汤（LB）液体培养基中培养，当 OD₆₀₀达到 0.5 - 0.8 时，添加终浓度为 0.5 mM 的异丙基 - β - 硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，随后将温度降至 20°C 孵育过夜。收集细胞后，经超声破碎、离心获取上清液，利用 Ni - NTA 树脂进行纯化，最后通过超滤离心去除高浓度离子，使用 Bradford 蛋白定量试剂盒测定纯化蛋白的浓度。

（二）QM/MM 模拟

按照已报道的方法构建酯键水解模型。选择反应位点周围约 300 个原子的簇进行研究，使用 Gaussian 16 软件结合 xtb 外部接口对过渡态（TS）进行初始优化，然后在 b3lyp/6 - 31g?? em = gd3bj 理论水平下进一步优化。采用水的 PCM 隐式溶剂模型表示酶的溶剂环境，进行频率计算确保只有一个虚频。在 ORCA 5.0.3 中，使用 RI - PBE/def2tzvp 结合 DFT - D 色散校正计算单点能量。

（三）MD 模拟

使用 Gromacs 2024.2 软件包和 GROMOS96 53a6 力场对 R1 结构域和 R1 domain_T11S 进行 MD 模拟。基于 C1 结构域（PDB: http://<firstglance.jmol.org/fg.htm?mol4NI6）使用 PyMol 构建模型，由于 Thr11（或 Ser11）与 Gln141 之间的酯键没有预定义的力场，因此在 “gromos53a6.ff” 文件的 “amino acids.rtp” 组件中手动将非标准残基 Thr11（或 Ser11）和 Gln141 分别定义为 TTT（或 SSS）和 GGG，并相应修改 “residuetypes.dat” 和 “specbond.dat” 文件。使用单点电荷（SPC）水模型在立方盒中心对蛋白质进行溶剂化，用 Na?或 Cl?离子替换随机水分子以中和系统。随后进行能量最小化，接着进行 1 ns（500,000 步）的 NVT 平衡和 1 ns 的 NPT 平衡（1 bar），最后在 300 K 下进行 100 ns（5,000,000 步）的 MD 模拟，并计算酯键周围 H?O 分子分布的径向分布函数（RDF）。对 EBCatcher、EBCatcher_A50P、ReverseCatcher、EXINU 和 EXINU - R1 结构域进行 MD 模拟时采用相同方法，其中 EXINU - R1 结构域的模型由 AlphaFold3 构建，并计算 EXINU 和 EXINU - R1 结构域中 EXINU 的均方根偏差（RMSD）。

（四）伞形采样模拟

为评估突变前后 Tag 和 Catcher 界面相互作用的变化，使用 Gromacs 2022.1 软件包和 “GROMOS96 53a6” 力场进行伞形采样模拟。首先，使用 Rosetta 2022.11 的 “relax.static.macosclangrelease” 模块使 EBTag/EBCatcher 或 EBTag/ReverseCatcher 复合物模型松弛，打断酯键。将 Catcher 指定为链 A，Tag 指定为链 B，在两条链的 N 端加上乙酰基封端，C 端去质子化（COO?基团）。将模型置于含有 SPC 水模型的立方盒中，对链 A 施加限制，对链 B 施加偏置力。加入 100 mM NaCl 中和系统，在 1 bar 和 310 K 下平衡 100 ps，然后进行最速下降法最小化。以 0.01 nm ps?1 的拉伸速率和 1,000 kJ mol?1 nm?2 的弹簧常数沿 x 轴将链 B 从核心结构拉开 500 ps，使 Tag 和 Catcher 的质心（COM）距离达到约 5.5 nm。从 500 ps 的拉伸轨迹中生成 500 个快照作为起始构型（伞形采样窗口），以约 0.2 nm 的间距在 0.5 - 5.0 nm 范围内对称分布采样窗口，最终对 EBTag/EBCatcher 使用 26 个窗口，对 EBTag/ReverseCatcher 使用 24 个窗口，每个窗口进行 10 ns 的 MD 模拟。使用加权直方图分析方法（WHAM）分析结果，并使用 Xmgrace 展示。

（五）AFM - SMFS 实验的蛋白质固定

在进行原子力显微镜单分子力谱（AFM - SMFS）实验前，对盖玻片（25 mm 直径，Sail Brand，中国）依次用去离子水、乙醇和异丙醇清洗，对探针（MLCT - BIO - DC，Bruker Corp）进行等离子体直接清洗。然后将探针和盖玻片浸入 1.3%（v/v）的 APTES 甲苯溶液中 1 h 引入 NH?基团，在两片固定的盖玻片之间加入 200 μL 磺基 - SMCC 溶液（1 mg/mL）于二甲基亚砜（DMSO）中，在黑暗中孵育 1 h。最后，使 Cys - ELP?? - GL 和 GL - ELP?? - Cys 肽分别与探针和盖玻片反应。进行 AFM - SMFS 测量时，将 50 μL 含有 300 μM Fgβ - (GB1)? - R1 domain - (GB1)? - NGL 和 30 μM OaAEP1 的储存缓冲液滴在载玻片上孵育 30 min，悬臂在含有 60 μM SdrG - ELP? - NGL 和 20 μM OaAEP1 的 50 μL 储存缓冲液中孵育。

（六）AFM - SMFS 实验

AFM - SMFS 实验使用 NanoWizard4 原子力显微镜进行。校准后，将探针短暂接触样品表面 20 - 50 ms，施加 100 - 400 pN 的力，通过特异性的 Fgβ:SdrG 蛋白质 - 蛋白质相互作用捕获目标蛋白。随后，以 1,600 nm/s 的恒定速度回缩探针，实验在 AFM 缓冲液（100 mM Tris [pH 7.4] 和 100 mM NaCl）中进行。

（七）酯键的形成和水解

酯键形成：将 10 μM 的 ReverseTag_GFP 和 10 μM 的 ReverseCatcher_GFP（或 ReverseCatcher_T11S_GFP）在室温下于反应缓冲液（100 mM HEPES，含 20% 甘油、1.5 M TMAO 和 100 μM CaCl?）中混合 30 min。酯键水解：向复合物中加入 1 M Na?CO?将 pH 调节至 8.0、9.0 或 10.0，在室温下孵育 30 min 促进酯键水解，使用 SDS - PAGE 分析酯键形成或水解的效率。

（八）FTIR 光谱

为确认 ReverseTag 与 ReverseCatcher（或 R1 结构域）之间酯键的形成，使用 Nicolet iS50 FTIR 光谱仪（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）记录 FTIR 光谱。将 20 mg 冻干的 ReverseTag_GFP、ReverseCatcher_GFP、ReverseTag_GFP:ReverseCatcher_GFP 和 Fgβ - (GB1)? - R1 domain - (GB1)? - NGL 粉末分别与 5 g 溴化钾（KBr）混合，在 500 - 4,000 cm?1 范围内以 4 cm?1 的分辨率采集 FTIR 光谱。

（九）目标蛋白的分子量测定

使用 MALDI - TOF - MS（Bruker，德国）测定 ReverseTag_GFP/ReverseCatcher_GFP、ReverseTag_GFP/ReverseCatcher_T11S_GFP 复合物以及 ReverseTag_GFP/ReverseCatcher_T11S_GFP 水解产物的分子量。具体操作是将 1 μL 样品置于 MALDI 板上，与 1 μL α - 氰基 - 4 - 羟基肉桂酸（HCCA）在室温下孵育 10 - 20 min 后进行 MALDI - TOF - MS 分析。

（十）CD 光谱

将样品用去离子水稀释至最终浓度为 0.2 mg/mL，使用 J - 810 CD 光谱仪（JASCO，日本）记录 CD 光谱。每个样品在 190 - 260 nm 范围内以 0.1 nm 的步长扫描，扫描速度为 50 nm/min，响应时间为 2 s，仪器自动计算并输出二级结构分布。

（十一）EXINU 活性测定

评估 EXINU 的酶活性时，将 10 μM 的酶与 20 g/L 菊粉（来自菊芋，聚合度 8 - 10，上海源叶生物科技有限公司）在缓冲液中混合反应 10 min，使用 3,5 - 二硝基水杨酸（DNS）法测定 D - 果糖的产量。测试 EXINU - N_ReverseCatcher_T11S/ReverseTag_EXINU - C 复合物的酶活性时，先将 10 μM 的 EXINU - N_ReverseCatcher_T11S 和 10 μM 的 ReverseTag_EXINU - C 在反应缓冲液（100 mM HEPES，含 20% 甘油和 1 mM CaCl?）中室温孵育 30 min 促进酯键形成，然后加入终浓度为 20 g/L 的菊粉反应 10 min。若需要水解酯键，则加入 1 M Na?CO?调节 pH 并在室温下反应 20 min，同样使用 DNS 法测量活性。DNS 法具体操作是将 10 μL 反应溶液和 90 μL 去离子水与 200 μL DNS 试剂混合，在 100°C 孵育 5 - 10 min，然后加入 900 μL 去离子水，测量 540 nm 处的吸光度。通过将不同浓度（0、0.2、0.4、0.6、0.8 和 1.0 mg/mL）的 D - 果糖（Solarbio，北京）溶液 100 μL 与 200 μL DNS 混合，绘制标准曲线。

（十二）BiFC 测定

将 10 μM 的 YFP - N_ReverseCatcher_T11S（或 YFP - N_ReverseCatcher_S11A）与 ReverseTag_YFP - C 在室温下于反应缓冲液（100 mM HEPES，含 20% 甘油、100 μM CaCl?和 1.5 M TMAO）中孵育 30 min，使用荧光分光光度计（F - 7000，Hitachi，日本）在 525 - 600 nm 范围内扫描荧光信号，激发波长设置为 514 nm。

四、资源可用性

如需进一步信息或索取资源和试剂，可联系通讯作者 Ling Jiang（[e-mail]）。本研究未生成新的独特试剂。支持本研究结果的数据可在文章、补充信息和 Data S1 中获取，本文未报告原创代码，如需重新分析本文数据所需的任何其他信息，可向通讯作者索取。

五、研究总结

本研究成功构建了可逆的肽标记系统 ReverseTag/ReverseCatcher，该系统能够快速形成酯键，且酯键可在特定条件下选择性水解。通过在 ReverseCatcher 中引入 T11S 突变，显著提高了酯键的水解效率，并且水解后的酯键可通过调节 pH 重新形成。将该系统应用于 EXINU，实现了通过 pH 精确调控酶活性。这一策略为控制酶功能提供了一种通用方法，在多酶催化、蛋白质工程等领域具有广阔的应用前景。未来，研究人员可进一步探索该系统在其他蛋白质和生物过程中的应用，优化其性能，推动相关领域的发展。