计算辅助设计助力开发营养缺陷型代谢传感器，实现对乙醛酸和乙醇酸的广泛检测

为解决构建营养缺陷型代谢传感器（AMS）耗时长、通量低的问题，研究人员设计并测试了基于大肠杆菌的 AMS，可检测乙醛酸和乙醇酸，为生物技术应用提供支持。

　　

研究背景

在生命的微观世界里，微生物的代谢过程如同精密运转的机器，每一个环节都至关重要。营养缺陷型代谢传感器（Auxotrophic Metabolic Sensors，AMS）作为研究微生物代谢的得力助手，能够将微生物的生长与特定代谢物的可利用性关联起来，在生物工程领域，如生长偶联设计中，发挥着不可或缺的作用。然而，传统构建 AMS 的方法就像手工打造一件复杂的工艺品，不仅耗时费力，而且通量极低，严重限制了其大规模应用和深入研究。

乙醛酸（Glyoxylate），这个在（合成）CO₂固定和碳守恒途径中扮演关键角色的代谢物，一直以来都是科研人员关注的焦点。但由于它并非野生型大肠杆菌生长所必需的代谢物，想要让大肠杆菌的生长依赖于乙醛酸，就需要对其代谢进行复杂的重新布线，这无疑是一项极具挑战性的任务。

为了攻克这些难题，来自丹麦技术大学诺和诺德基金会生物可持续性中心、德国马克斯?普朗克陆地微生物研究所等多个机构的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Nature Communications》上，为该领域带来了新的曙光。

研究方法

研究人员首先运用了一种中等规模的代谢模型 ——iCH360 模型，它就像是一张精心绘制的微生物代谢地图，涵盖了核心代谢和关键代谢途径。通过在这个模型中加入与乙醛酸代谢相关的反应，为后续的研究奠定了基础。接着，利用通量平衡分析（Flux Balance Analysis，FBA）算法，在众多可能的基因敲除（Knockout，KO）组合中，筛选出能够使大肠杆菌生长依赖于乙醛酸的设计方案。在实验验证阶段，采用 λ - red 重组工程或 Cas9 介导的碱基编辑技术对大肠杆菌进行基因敲除，构建出一系列 AMS 菌株，并通过¹³C 标记实验、蛋白质组学分析以及高效液相色谱 - 质谱联用（HPLC - MS/MS）等技术，对菌株的代谢特性和检测能力进行了全面深入的研究。

研究结果

1. 系统筛选生长偶联设计：研究人员借助扩展的中等规模模型，对不同基因敲除组合如何影响大肠杆菌对乙醛酸的生长依赖性进行了系统探究。他们设定最多两个基因敲除以促使细胞利用乙醛酸进行生物量积累，并在两种不同的主要碳源（甘油和琥珀酸）条件下展开搜索。最终确定了五种设计方案，这些方案涵盖了不同的乙醛酸衍生生物量前体和需求，为后续构建 AMS 菌株提供了重要依据。
2. 代谢传感器工程构建与验证：根据筛选出的设计方案，研究人员成功构建了一系列 AMS 菌株。以依赖糖酵解 / 糖异生途径中断的菌株为例，通过对相关基因的敲除，如构建 ΔtpiA ΔmgsA 双突变体（LOW - AUX 菌株），并利用¹³C 标记实验，证实了乙醛酸在生物量前体合成中的重要贡献。在构建中断三羧酸循环（TCA）回补途径的菌株时，通过对多个基因的精确调控，如 TCA - AUX 和 2OXO - AUX 菌株，同样验证了乙醛酸在这些菌株代谢中的关键作用。此外，针对通过转氨作用合成甘氨酸的设计，构建了 C1 + GLY - AUX 和 GLY - AUX 菌株，不仅证明了这些菌株对乙醛酸的生长依赖性，还发现了可能参与乙醛酸转化为甘氨酸的关键酶 HisC。
3. 代谢传感器检测性能分析：研究人员对构建的代谢传感器进行了全面的性能分析。通过监测不同乙醛酸补充浓度下菌株的生长情况，发现这些传感器能够在 10 μM 至 20 mM 的乙醛酸浓度范围内呈现出良好的生长响应，检测范围跨越三个数量级。当将传感器的检测范围扩展到乙醇酸时，同样取得了令人满意的结果。由于乙醇酸脱氢酶复合物（GlcDEF）能够将乙醇酸氧化为乙醛酸，使得传感器菌株在检测乙醇酸时也能表现出与检测乙醛酸类似的生长依赖性，且检测浓度范围同样可达三个数量级。
4. 体内测试与环境监测应用：研究人员利用构建的代谢传感器对苹果酸硫激酶（MtkAB）和苹果酰 - CoA 裂解酶（Mcl）进行了体内测试。这两种酶参与的反应模块在多种代谢途径中具有重要作用，如丝氨酸循环、HydrOxyPropionyl - CoA/Acrylyl - CoA（HOPAC）循环等。通过将不同表达强度的 mtkAB 和 mcl 基因转化到代谢传感器菌株中，研究发现不同的表达构建体会导致菌株生长速率的差异，从而为优化代谢途径提供了重要参考。在环境监测方面，研究人员以蓝藻 Synechococcus elongatus 为研究对象，利用代谢传感器检测其在光呼吸过程中分泌的乙醇酸。实验结果表明，传感器菌株的生长情况与乙醇酸浓度密切相关，通过测量菌株的最大光密度（maxOD₆₀₀），可以较为准确地推断出样品中乙醇酸的浓度，为环境中乙醇酸的监测提供了一种新的有效方法。

研究结论与意义

本研究成功地开发了一套系统的工作流程，用于设计、构建和测试基于大肠杆菌的多功能 AMS，实现了对乙醛酸和乙醇酸的广泛检测。研究中使用的中等规模代谢模型，相较于以往的核心模型，能够探索更多的设计方案，同时减少了计算时间和不可行的解决方案。通过对多种 AMS 菌株的构建和表征，不仅展示了它们在代谢途径工程和环境监测中的应用潜力，还为进一步研究微生物代谢提供了有力的工具。

在代谢途径工程方面，这些传感器可以帮助研究人员更深入地了解代谢模块的功能和相互作用，为优化生物合成途径提供指导。在环境监测领域，能够快速、准确地检测环境中的乙醇酸浓度，对于研究光呼吸过程以及评估微生物在生态系统中的作用具有重要意义。此外，这种计算辅助设计的方法具有广泛的适用性，有望为其他代谢物的传感器设计提供借鉴，推动生物技术在更多领域的应用和发展。