优化实验室技术评估预剥离 DMEK 移植物质量：突破困境，精准评估

研究人员针对预剥离 DMEK 移植物评估难题，优化相关技术，提升评估准确性与效率，意义重大。

　　角膜，作为眼睛的 “窗户”，对于视力起着至关重要的作用。一旦角膜出现问题，如角膜内皮功能失代偿等疾病，角膜移植便成为恢复视力的重要手段。在众多角膜移植技术中，Descemet 膜内皮角膜移植术（DMEK）凭借其视觉恢复效果好、排斥风险低等优势，近年来备受青睐。在美国，2014 - 2022 年期间，DMEK 在角膜移植手术中的占比从 6% 飙升至 32% ；在欧洲，2018 年 DMEK 占角膜移植手术的 29.7% ，德国更是在 2021 年让 DMEK 成为主导的角膜移植术式，占比达 65% 。

为了简化手术流程，降低手术因移植物问题取消的风险，眼库越来越多地制备 DMEK 移植物，其中预剥离 DMEK 移植物的数量也在不断增加。然而，评估预剥离 DMEK 移植物的质量却困难重重。目前，基于 Calcein - AM 的内皮细胞活力检测方法虽常用，但存在诸多问题。一方面，在检测预剥离 DMEK 移植物时，Calcein 染色对比度差，难以准确评估活力；若将移植物从角膜上分离、平铺后再检测，又会额外造成内皮细胞损伤，导致检测结果无法反映移植物的初始状态。另一方面，该检测后的样本因 Calcein - AM 和 Ethidium 的残留荧光，无法进行后续的免疫荧光（IF）检测，这不仅浪费了宝贵的人类角膜组织，也限制了对移植物更深入的研究。

为了解决这些问题，法国 Jean Monnet 大学医学院眼科生物学、工程与成像实验室（BiiO）等机构的研究人员开展了相关研究。他们的研究成果发表在《Scientific Reports》上，为评估预剥离 DMEK 移植物质量提供了新的方向和方法。

研究人员采用了多种技术方法。首先，使用人角膜进行实验，这些角膜来自于年龄为 75±16（62 - 100）岁的捐赠者，死后间隔 11±6（4 - 24）小时，在器官培养系统中保存 19±11（4 - 36）天，因不适合移植被视为生物废弃物。其次，制备预剥离 DMEK 移植物，通过一系列精细操作，如用细齿镊子切除小梁网、用分离器分离 Descemet 膜（DM）与角膜基质等。最后，进行内皮细胞活力检测和免疫荧光检测，并对相关实验条件进行优化。

研究结果如下：

1. Calcein - AM 浓度和稀释剂的影响：研究人员测试了不同浓度（2μM 和 4μM）的 Calcein - AM 在不同稀释剂（PBS 和 Opti - MEM）中的染色效果。结果显示，与传统的 2μM Calcein 在 PBS 中相比，4μM Calcein 在 Opti - MEM 中的荧光强度提高了三倍。同时，使用 PBS 作为稀释剂会导致角膜内皮细胞出现裂纹，破坏细胞连接，而 Opti - MEM 则无此现象。
2. 台盼蓝（TB）染色的作用：在使用 4μM Calcein - AM in Opti - MEM 染色后，进行 TB 染色。结果发现，TB 染色显著降低了非特异性荧光，增强了 Calcein 染色的对比度。这使得不同操作人员之间的差异显著降低（从 “before TB” 组的 6.1±4.3% 降至 “after TB” 组的 3.5±1.8%），活力计数时间也明显缩短（从 “before TB” 组的 10.3±7.4 分钟降至 “after TB” 组的 5.6±1.7 分钟）。此外，TB 染色还能清晰显示 DM 的边界和附着区域，有助于评估剥离技术和移植物质量，同时在检测中能更好地辅助活细胞 ECD 计数。
3. 免疫荧光（IF）检测的优化：传统的 HEC 活力检测后，残留的 Calcein 和 Ethidium 会干扰 IF 检测。研究人员通过使用 Hoechst 和 Calcein - AM（HC）组合染色并省略 Ethidium，以及对固定和通透化后的移植物进行长时间 PBS 洗涤，成功实现了后续的 NCAM 和 ZO - 1 的双 IF 检测。

研究结论和讨论部分表明，该研究的技术优化具有重要意义。一方面，优化后的 Calcein 染色提高了检测的可靠性和速度，有助于更准确地评估移植物质量。另一方面，TB 染色不仅改善了染色效果，还能辅助判断 DM 的状态和附着位置，方便 ECD 计数。此外，优化后的方法还适用于其他类型的角膜移植物，如穿透性角膜移植术（PK）和 Descemet 膜剥离自动化内皮角膜移植术（DSAEK）移植物的评估。这一系列技术优化为眼库和临床医生提供了更有效的工具，有望提高角膜移植手术的成功率，改善患者的视力预后。