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本文通过对韩国肉牛多部位样本 16S rRNA 基因测序，揭示其肠道微生物组发育规律，为肉牛研究提供重要数据。
引言
肉牛产业在动物设施、饲养、福利、育种、畜群管理和生物制药使用等方面取得了显著进展。牛不仅是人类重要的蛋白质来源，还能高效地将植物生物质转化为可被动物吸收利用的营养物质，为人类提供牛奶和肉类，在利用太阳能方面发挥着重要作用。
在牛的消化系统中，瘤胃微生物尤其是细菌，对其消化过程至关重要。细菌在瘤胃微生物群落中占比超过 91%，成年反刍动物主要依靠瘤胃微生物来消化难以消化的植物性饲料。瘤胃细菌产生的挥发性脂肪酸和蛋白质，能为奶牛提供超过 70% 的所需能量和 60% 的非氨氮。
然而，哺乳期的犊牛由于瘤胃发育不完善，具有单胃动物的特征，其能量主要来源于母乳。在这个阶段，犊牛小肠和大肠中微生物群落的初始组装和后续成熟，对其营养吸收、疾病易感性以及进一步的生长发育至关重要，这与单胃动物的情况类似。鉴于肠道微生物对哺乳动物婴儿的免疫、营养、代谢和生理等方面有着重要影响，了解犊牛在新生儿期和生长期肠道中的微生物特征十分必要。
在先前的研究中，研究团队发现通过粪便微生物群移植（将健康犊牛的粪便注入腹泻犊牛体内）恢复正常的肠道微生物组组装，比传统的抗生素治疗对新生犊牛更有效，这种方法能显著降低死亡率并增加农场收入。因此，了解从新生犊牛阶段到发育阶段牛的正常肠道微生物组组装具有重要意义。
研究内容
本研究对 57 头健康、未使用抗生素的韩国棕色肉牛（Bos taurus coreanae，韩国最常见的品种）进行了研究，收集了从新生儿到青春期后的多个样本，包括 420 份纵向粪便样本（256 份来自雄性犊牛，164 份来自雌性犊牛）、20 份瘤胃内容物、17 份小肠内容物和 18 份大肠内容物。同时，还收集了 8 个宿主饮食样本，包括 6 份母乳样本和 2 份饲料样本。
样本采集时间点对应犊牛的主要发育阶段：1 - 7 天（T1）、8 - 15 天（T2）、16 - 23 天（T3）、24 - 30 天（T4）、1 - 2 个月（T5）、2 - 4 个月（T6）、6 个月（T7）、12 个月（T8）。在 24 个月（T9）时，随机选择 20 头牛（10 头雄性和 10 头雌性），收集其瘤胃、大肠和小肠的内容物。
收集的样本经过 DNA 提取、V3 - V4 16S rRNA 基因 PCR 扩增，然后使用 Illumina MiSeq 平台进行测序，并进行生物信息学分析。
实验方法
- 伦理审批：本研究的实验方案经过庆熙大学机构动物护理和使用委员会批准（KHUASP [SE] - 17 - 026、KHUASP [SE] - 17 - 028 和 KHUASP [SE] - 17 - 145），实验按照 ARRIVE 指南进行。
- 实验动物：实验所用母牛均为韩国棕色牛，它们可自由获取食物和水，在个体牛舍中由母亲哺育。犊牛在出生 60 天后断奶，断奶前与母亲共同生活，断奶后与母亲分离并单独饲养。所有犊牛在每个生长阶段都被提供相同的饮食，以尽量减少个体间肠道微生物群的差异。雄性犊牛在 8 个月大时进行去势手术。排除先前使用过抗菌剂或有传染病史的犊牛。
- 正常犊牛筛选：根据犊牛的营养状况和身体条件，如鼻子、耳朵、嘴巴、尾巴、毛发或臀部清洁情况，选择出生日期相近的犊牛。排除接受过抗菌治疗（抗生素、抗真菌药或抗病毒药）或有传染病史（包括炭疽、口蹄疫、牛传染性胸膜肺炎或布鲁氏菌病）的犊牛。使用布里斯托大便量表评估粪便，评分在 3 - 4 分的犊牛被认为健康。通过诊断性多重 PCR 检测粪便样本中的特定病原体，阳性的犊牛也被排除。最终，根据筛选标准选择了 57 头犊牛用于本研究数据集。
- 样本采集：使用直肠灌肠法收集粪便样本，收集者佩戴干净的一次性乳胶手套。在不同时间点收集粪便样本，在 24 个月时收集瘤胃、小肠和大肠内容物。同时收集饲料颗粒和母乳样本，收集母乳时，先用 70% 乙醇浸湿的棉球擦拭奶牛的乳房和乳头，并弃去最初挤出的少量牛奶，以防止环境微生物污染。收集的样本用干冰运输到实验室，并储存在 - 80°C 直至使用。
- DNA 提取和 V3 - V4 16S rRNA 基因扩增子测序：使用 Repeated Bead - Beating plus column（QIAamp DNA Stool Mini Kit；Qiagen）从粪便、母乳和饲料样本中提取细菌基因组 DNA。通过 PCR 扩增 16S rRNA 基因的高变 V3 - V4 区域，使用特定的正向和反向引物，PCR 反应条件经过优化。PCR 产物经过纯化后，使用 Nextera XT Index（Illumina）制备扩增子文库，并在 Illumina MiSeq 平台上进行 2 × 300 bp 测序。
- 生物信息学分析：使用 FastQC 和 MultiQC 评估原始数据质量，使用 Cutadapt 去除 PCR 引物序列，将处理后的数据导入 Qiime2 平台进行后续分析。利用 DADA2 管道将序列去噪为扩增子序列变体（ASVs），并设置特定参数。使用 SILVA 138 SSURef NR99 数据库和相关插件进行分类学注释，构建系统发育树。去除长度低于 284 nt 或归类为 “叶绿体” 或 “线粒体” 的 ASVs，不用于下游分析。
- 数据可视化：除部分图外，使用 R 包 ggplot2、cowplot、ggalluvial、ggrepel、ggtext 和 tidygraph 进行数据可视化，相关数据先导入 R 并使用 phyloseq 和 microbiome 包进行处理。
数据记录
- 原始测序数据：从牛的肠道内容物、粪便、牛奶和饲料样本中获得的 16S rRNA 基因原始序列，已存入 NCBI 序列读数存档（SRA），登录号为 SRP520455。
- 样本元数据：所有 483 个测序样本的元数据记录在补充表 1 中，也以 “Metadata.tsv” 文件名存入 Zenodo。元数据包含样本名称、犊牛 ID、采样时间点、样本来源和宿主性别等信息。
- 可直接使用的处理后数据：处理后的最终数据已存入 Zenodo，包括 ASV 丰度表（“ASV_table.tsv”）、每个 ASV 的代表性序列（“Representative_ASV_sequences.fasta”）、ASVs 的系统发育树（“Phylogenetic_tree.nwk”）和 ASVs 的分类注释（“Taxonomy.tsv”）。这些数据已处理为可直接分析的格式，可直接导入分析程序如 Qiime2 或 R。
技术验证
- 潜在 DNA 污染物评估：对所有用于 DNA 提取的试剂进行 PCR 检测，以确定是否存在潜在污染物。使用特定引物进行 30 个循环的 PCR 反应，结果显示无明显污染。每次测序运行时，还包括标准模拟群落、DNA 提取对照和阴性 PCR 对照，以确保质量。通过将标准模拟群落的代表性 ASV 序列与 SILVA 123 QIIME 兼容数据库比对，对 ASVs 进行分类学注释。
- 序列质量评估和生物信息学流程：使用 FastQC 软件评估原始数据的测序质量，通过 MultiQC 合并 FastQC 报告并检查测序质量问题。大多数读数的质量得分高于 Q20。由于 DADA2 管道会根据测序质量信息生成错误模型并独立进行质量过滤，因此在使用 DADA2 管道前不建议进行额外的质量过滤。使用 Cutadapt 去除不含有正确引物序列的读数，并去除长度低于 284 nt 或归类为 “叶绿体” 或 “线粒体” 的 ASVs，以保证数据质量。
用法说明
研究生成的 ASV 丰度表、代表性序列、系统发育树、分类注释和样本元数据已上传至 Zenodo，这些数据已处理为可直接分析的格式，可直接导入分析程序。如果研究人员计划将这些数据与其他数据集整合用于特定目的（包括荟萃分析），建议标准化分析流程，以减少因不同分析方法和参数导致的分析差异。为此，研究人员可以从 NCBI SRA 下载原始数据，登录号为 SRP520455。
研究意义
本研究扩展了与牛肠道微生物组发育相关的资源收集，所提供的数据集有助于理解牛的发育与肠道微生物组之间的关系，以及对与牛相关的、了解较少的共生细菌正常组装的特征描述。这些数据有望为开发提高牛生产力和抗病能力的育种和治疗策略奠定基础。通过深入研究牛肠道微生物组，未来或许能够更精准地调控牛的健康和生长，推动肉牛产业的可持续发展，在保障肉类供应的同时，提高养殖效益和动物福利。
