柑橘木腐病背后的 “元凶”：地中海东部地区葡萄座腔菌科物种揭秘

为探究土耳其柑橘木病病因，研究人员鉴定出 5 种葡萄座腔菌科物种，明确其致病性，为病害防治提供依据。

　　柑橘，作为全球经济价值极高的水果作物，在 140 多个国家的热带、亚热带和地中海气候区广泛种植。土耳其，凭借其适宜的气候条件，成为世界柑橘的主要生产国之一，广袤的 172,900 公顷种植面积，每年贡献着 4,512,808 吨的丰硕产量。然而，在这片柑橘的 “绿色海洋” 中，一场悄无声息的危机正悄然蔓延。

近年来，在土耳其地中海东部地区的柑橘果园里，果农们发现自家的柑橘树出现了异常状况。原本生机勃勃的树枝开始泛黄、枯萎，树干和主枝上出现了流胶现象，严重时甚至导致整棵树死亡。这些症状不仅影响了柑橘的产量和品质，也给果农们带来了巨大的经济损失。而造成这一切的 “幕后黑手”，正是各种真菌病害。葡萄座腔菌科（Botryosphaeriaceae）真菌，便是其中的主要 “元凶” 之一。它们常常潜伏在柑橘树的枝干中，引发枝干溃疡、枝枯病等，严重威胁着柑橘产业的健康发展。

为了揭开这些病害的神秘面纱，找到有效的防治方法，来自土耳其哈塔伊穆斯塔法?凯末尔大学（Hatay Mustafa Kemal University）植物健康诊所实施与研究中心、意大利都灵大学（University of Torino）等机构的研究人员?ener Kurt、Aysun Uysal 等人开展了深入研究。这项研究成果发表在《Journal of Plant Pathology》杂志上，为柑橘病害的防治提供了重要的理论依据和实践指导。

在本次研究中，研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：

• 样本采集与真菌分离：2019 - 2020 年，研究人员在土耳其地中海东部地区的阿达纳（Adana）、梅尔辛（Mersin）和哈塔伊（Hatay）三省的 38 个商业柑橘果园进行了调查。从表现出枝枯、流胶和溃疡症状的柑橘树（包括柠檬（C. limon）、柑橘（C. reticulata）和橙子（C. sinensis））上采集样本，通过一系列消毒处理后，将样本接种在添加了阿莫西林的马铃薯葡萄糖琼脂（PDA - A）培养基上进行培养，随后通过单菌丝尖端分离法纯化得到真菌菌株。
• DNA 提取、PCR 扩增与测序：使用 DNeasy Plant Mini Kit 试剂盒从 7 天龄的菌丝体中提取总基因组 DNA，测定浓度后，选取核核糖体内部转录间隔区（ITS）、部分翻译延伸因子 - 1α（tef - 1）基因和 β - 微管蛋白（tub2）基因这三个基因组位点进行扩增。分别使用 ITS4/ITS5、EF1 - 728F/EF2986R 和 Bt2a/Bt2b 引物对进行 PCR 扩增，扩增产物经高分辨率毛细管电泳检测后，送测序公司进行双向测序。
• 系统发育分析：将新获得的序列与 NCBI GenBank 核苷酸数据库中的序列进行比对，通过 MAFFT v. 7 在线服务器进行序列比对，必要时用 MEGA v. 7 手动调整。分别对每个基因位点进行系统发育分析，再对三个串联位点进行多基因座分析。采用贝叶斯推断（BI）和最大简约法（MP）构建系统发育树，确定所研究菌株的分类地位。
• 致病性测试：选取 5 种代表性菌株（MDS4（Diplodia seriata）、LDo1（D. olivarum）、ODv6（Dothiorella viticola）、MNp3（Neofusicoccum parvum）和 MNn8（Neoscytalidium dimidiatum）），接种在 2 年生健康盆栽柑橘树上。用无菌刀片在树皮上造成伤口，将 7 天龄的菌丝体菌块接种在伤口处，以接种 PDA 菌块的植株作为对照。60 天后观察植株症状，测量内部病斑长度，并从发病组织中重新分离真菌，通过菌落形态和 ITS 测序鉴定，以验证科赫法则（Koch’s postulates）。

研究结果如下：

• 调查与真菌分离：在调查区域的柑橘果园中，均发现了表现出症状的柑橘植株。从这些植株上共分离得到 30 株形态类似葡萄座腔菌科的真菌，其中多数菌株分离自变色的树干和死亡的树枝。根据形态特征初步判断这些菌株属于葡萄座腔菌科，随后选取 10 株进行分子鉴定，每种再选取 1 株进行致病性试验。
• 系统发育分析：通过对 ITS、tef - 1 和 tub2 序列的单基因座和多基因座系统发育分析，明确了所研究菌株的分类地位。结果显示，1 株菌株（LDo1）与 D. olivarum 的指定模式菌株和其他 3 个参考菌株聚类在一起；2 株菌株（MDs2 和 MDs4）与 D. seriata 的模式菌株和另外 6 个参考菌株聚类；2 株菌株（ODv2 和 ODv3）与 Do. viticola 的两种标本和其他 4 个参考菌株聚为一类；5 株菌株（LNp2、LNp3、LNp9、MNp3 和 MNp4）与 8 个 N. parvum 的参考菌株聚类；2 株菌株（MNn8 和 MNn11）与 6 个 Ne. dimidiatum 的参考菌株聚类，包括 Ne. dimidiatum 的两种类型以及 Ne. novaehollandiae 和 Ne. orchidearum 的模式菌株。
• 致病性测试：所有接种的菌株在接种 60 天后均能使柑橘嫩枝出现枯萎症状，嫩枝上出现棕色至巧克力棕色的病斑，并在接种点附近观察到典型的葡萄座腔菌科流胶症状。基于症状嫩枝数量计算的病害指数（DI）为 100%。不同菌株的致病力存在显著差异，N. parvum 的致病力最强，在不同柑橘品种上引起的平均病斑长度最长；Ne. dimidiatum 的致病力最弱。

研究结论与讨论：本研究首次证实了葡萄座腔菌科真菌在土耳其地中海东部地区柑橘主产区的存在。通过分子和系统发育分析，鉴定出 5 种与柑橘枝枯、溃疡和流胶相关的葡萄座腔菌科物种：D. seriata、D. olivarum、Do. viticola、N. parvum 和 Ne. dimidiatum。这些物种在世界其他柑橘种植地区也有报道，是重要的柑橘病原菌。在调查区域，从柑橘上分离得到的真菌菌株主要来自柑橘和柠檬，N. parvum 是分离频率最高的物种，其次是 D. seriata。

葡萄座腔菌科真菌可以在不同寄主之间传播，对周边果园构成潜在威胁。本研究中的致病性测试表明，所有鉴定出的物种都能感染受伤的柑橘嫩枝，但致病力存在差异。了解病原菌的致病力以及准确鉴定病原菌，对于制定有效的病害管理策略至关重要。在土耳其，柑橘种植面积逐年增加，葡萄座腔菌科真菌引起的感染对果农来说是日益严重的问题。目前，当地主要通过在雨季修剪和清除果园中的枯枝落叶来管理柑橘葡萄座腔菌科流胶病，但还需要进一步开展大规模调查，以完善和发展更有效的柑橘病害管理措施。未来，还应开展流行病学研究，确定整个生长季节的高风险感染期，为柑橘病害的精准防控提供更有力的支持。