用于研究囊性纤维化中黏液纤毛清除功能障碍的患者来源 3D 打印肺气道模型

本文构建了患者来源的 3D 打印肺气道模型，可监测黏液纤毛清除（MCC），助力囊性纤维化（CF）研究与治疗。

　　

一、研究背景

黏液纤毛清除（Mucociliary Clearance，MCC）作为呼吸系统的天然防御机制，通过呼吸道纤毛细胞的协同运动，捕获并清除环境中的有害物质，对维持肺部健康起着至关重要的作用。一旦 MCC 功能受损，会引发一系列严重的肺部疾病，如哮喘、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、支气管扩张以及囊性纤维化（Cystic Fibrosis，CF）等。这些疾病不仅严重影响患者的生活质量，还显著增加了发病率和死亡率。

CF 是一种由囊性纤维化跨膜传导调节因子（Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator，CFTR）基因突变导致的遗传性疾病。CFTR 蛋白作为一种环磷酸腺苷（cAMP）介导的氯离子转运通道，存在于大多数上皮细胞的顶膜上。当肺部气道上皮细胞顶膜的 CFTR 通道活性丧失或功能异常时，会致使纤毛周围和黏液层脱水，进而引发炎症、细菌感染、MCC 功能受损以及气道黏液堵塞等问题。

CF 在全球范围内影响着众多人群，在美国，每 3500 名活产婴儿中就有 1 例 CF 患者，目前全球约有 105,000 人患有 CF，呼吸衰竭是 CF 患者的主要死因。尽管针对 CFTR 的研究不断深入，近年来也有一些临床有效的治疗方法问世，但这些 CFTR 调节剂的作用机制及其对 MCC 的影响仍未完全明晰，因此迫切需要开发更有效的研究模型，以深入了解 CF 的病理生理机制，并为候选药物的测试提供更好的方法。

在气道疾病研究领域，缺乏能够准确模拟肺气道组织的合适体外模型，成为阻碍研究进展的一大难题。传统的细胞培养系统和动物模型在临床相关性方面存在明显局限性，无法真实再现人类的病理生理过程。现有的体外气道模型通常是在滤膜上培养的上皮单层细胞，这种模型不能完整地反映体内组织环境，缺乏天然细胞外基质（Extracellular Matrix，ECM），且无法在三维空间中进行细胞共培养，限制了对复杂细胞 - 细胞、细胞 - 基质相互作用的研究。动物模型在气道发育和疾病病理方面与人类存在显著差异，实验结果准确性欠佳，还面临实验变量难以控制和伦理问题的困扰。因此，开发更有效的、具有临床相关性的人道替代模型迫在眉睫。

随着组织工程技术的不断发展，3D 生物打印技术应运而生，并在过去十年中为组织工程领域带来了革命性的变化。该技术能够在三维支架上培养活细胞，高度模拟人体器官的结构和功能。其独特的个性化设计和精确制造能力，可实现对嵌入细胞群体、生物材料和生长因子的精细空间控制，以逐层构建组织构建体。相较于传统的 2D 模型，3D 生物打印的体外模型在生理相关性和复杂性方面具有显著优势，为疾病建模和治疗筛选提供了更理想的平台，有望缩小临床前研究与临床试验之间的差距。

近年来，3D 生物打印体外气道疾病模型的开发备受关注，其在模拟人类气道组织的复杂结构和功能方面展现出巨大潜力，为研究 CF、COPD、特发性肺纤维化（IPF）和病毒感染等多种气道疾病提供了新的途径。尽管这些模型为气道疾病研究奠定了基础，但仍存在不足，如缺乏对患者特异性 MCC 的深入研究，无法充分模拟原生气道中纤毛上皮细胞与黏液层之间的动态相互作用。为填补这一知识空白，本研究致力于设计和开发一种患者来源的 3D 肺黏膜下腺导管气道模型，实现对 MCC 的实时监测和患者特异性药物测试。

二、研究成果

1. 患者来源黏膜下腺及上皮细胞的分离：研究人员从肺移植供体的近端肺组织中成功分离出黏膜下腺及黏膜下腺上皮细胞。黏膜下腺位于上肺气道的上皮层与软骨之间，通过免疫荧光显微镜观察证实，腺体通过纤毛收集管与表面上皮相连，且能产生凝胶形成性黏液 MUC5B，并通过黏膜下腺导管分泌到气道表面。研究人员运用显微解剖技术，成功获取了高纯度的黏膜下腺簇，并从中分离出黏膜下腺上皮细胞。通过组织学染色、RNA 测序和单细胞 RNA 测序（scRNA - seq）等多种方法，对分离的组织和细胞进行了全面的表征和纯度验证，结果表明所获得的细胞具有较高的纯度，且符合实验要求，为后续研究提供了可靠的细胞来源。
2. 黏膜下腺上皮细胞的分化：为研究患者来源的黏膜下腺上皮细胞的纤毛摆动频率（Ciliary Beat Frequency，CBF）和 MCC 功能，研究人员对其进行了分化诱导。将收获的黏膜下腺上皮细胞接种在 Transwell 膜上，在气液界面（Air - Liquid Interface，ALI）条件下进行培养。随着时间推移，细胞逐渐极化并在 8 天内长出纤毛，分化为纤毛细胞和黏液分泌上皮细胞。免疫荧光显微镜观察显示，MUC5B 在黏液细胞中高度表达，细胞角蛋白 14（KRT14）标记的肌上皮细胞位于极化细胞的基底层。通过 scRNA - seq 分析发现，分化前的细胞主要由基底细胞、分泌祖细胞等组成，而分化后细胞类型更加多样化，包括更多的分泌亚型、纤毛细胞以及离子细胞等罕见细胞类型，进一步证实了基底细胞是未分化黏膜下腺 ALI 中的主要细胞来源，可分化为多种细胞类型。
3. 功能测量：研究人员对 CF（ΔF508/ΔF508）和非 CF 患者来源的黏膜下腺上皮细胞进行了批量 RNA 测序（bulk RNA - seq）分析，比较了分化前后 CFTR 转录本的变化。结果显示，分化后 CF 和非 CF 细胞的 CFTR 转录本均显著增加，但两者之间的转录本数量相似。通过监测短路电流评估 CFTR 功能发现，CF 患者来源的细胞由于 CFTR 蛋白转运障碍，CFTR 功能完全缺失；而经过 Trikafta（一种由 elexacaftor、tezacaftor 和 ivacaftor 组成的 FDA 批准的 CFTR 调节剂）治疗后，CFTR 功能得到显著改善。同时，研究人员还通过高速数字相机记录纤毛运动，对纤毛功能进行分析，发现 CF 细胞的 CBF 略低于非 CF 细胞。
4. 患者来源 3D 肺导管气道构建体的开发：研究人员设计并构建了患者来源的 3D 肺导管气道构建体。首先，利用 3D 生物打印技术，将基于水凝胶的 ECM 与人类肺成纤维细胞混合，制备出多层管状结构的气道支架，并通过光交联使其稳定，以适应细胞培养条件。实验表明，成纤维细胞在支架内能够迁移和增殖，形成三维互连网络结构，且细胞存活率较高。随后，将 CF 和非 CF 供体来源的黏膜下腺上皮细胞接种在支架的管腔内，在 ALI 条件下培养。上皮细胞逐渐迁移并极化，分化为黏液分泌细胞和纤毛细胞，在 14 天内形成上皮细胞衬里，成功构建出模拟体内气道环境的 3D 肺导管气道模型。
5. 监测 MCC 和 CBF：在构建的 3D 肺导管气道模型上，研究人员对 CF 和非 CF 患者来源的模型进行了 MCC 和 CBF 的实时监测。通过跟踪添加到支架管腔内的荧光微珠的速度，定性和定量地测量了 MCC 速度（MCCV）。结果发现，非 CF 支架中的微珠运动快速、平稳、连续且有方向性，而 CF 支架中的微珠运动则缓慢、不规则且缺乏方向性，CF 气道支架的 MCCV 明显低于非 CF 气道支架。给予 CF 支架 Trikafta 治疗后，MCCV 部分恢复，微珠运动的方向性得到改善，速度提高了 2.5 倍。同时，通过相差显微镜和高速视频显微镜对 CBF 进行定量测量，发现 CF 气道支架的 CBF 低于非 CF 气道支架。

三、研究讨论

本研究首先成功分离了患者来源的原发性细胞，包括产生 MUC5B 的黏膜下腺和黏膜下腺导管上皮细胞，并建立了高效的细胞培养、扩增和分化方法。通过 scRNA - seq 分析，对细胞分化前后的细胞类型和群体进行了深入研究，为后续实验提供了坚实的细胞基础。

利用 3D 生物打印技术构建的人类肺黏膜下腺导管气道模型，能够有效模拟体内气道环境。肺成纤维细胞在 3D 气道支架内迁移和增殖，形成复杂网络，患者来源的黏膜下腺上皮细胞在管腔内极化、分化为纤毛细胞和黏液细胞，实现了对体内气道结构和功能的高度模拟。

该模型实现了对患者特异性 MCC 的原位体外监测，通过整合患者来源的原发性细胞、ECM 和 3D 生物打印系统，显著提高了监测 MCC 对 CFTR 调节剂反应的敏感性。与传统的 2D 模型和现有的 3D 模型相比，本研究开发的 3D 生物打印气道模型具有显著优势，它克服了传统模型在模拟天然气道上皮方面的局限性，能够在三维环境中进行实时 MCC 监测和患者特异性药物测试。

然而，CF 患者中 CFTR 突变和其他遗传因素存在广泛差异，这可能影响上皮细胞功能和药物反应，进而对模型的可重复性产生影响。未来研究应纳入来自多个供体、具有不同 CFTR 突变、疾病严重程度和年龄组的上皮细胞，以评估患者个体差异对 MCC 和药物反应的影响，提高模型在个性化药物测试中的稳健性和临床实用性。

此外，为进一步优化模型，可考虑以下改进方向：一是引入免疫细胞等更多细胞类型，以更全面地反映气道微环境及其在 CF 病理过程中的相互作用，有助于阐明免疫反应在 MCC 和感染易感性中的作用；二是在模型中添加血管化和灌注系统，提高模型的生理相关性和功能，更好地评估药物递送和免疫反应；三是利用具有特定 CFTR 突变的患者来源上皮细胞，在该平台上再现个体反应，评估 CFTR 调节剂疗法的疗效，推动个性化医学的发展。

综上所述，本研究构建的 3D 气道疾病模型整合了原位 MCC 监测和患者特异性药物测试功能，有效解决了现有体外系统的关键局限性，为研究气道疾病和药物测试提供了一个生理相关性高的平台，有望推动针对 CF 患者 MCC 改善的治疗策略的发展。