细菌约瑟夫蛋白家族的去泛素化酶效应子：结构、功能与机制

本文揭示细菌约瑟夫蛋白家族去泛素化酶（DUB）效应子的特性，包括独特剪切活性及结构基础。

　　

引言

蛋白泛素化（Protein ubiquitination）作为一种关键的翻译后修饰方式，在真核细胞生物学的诸多方面发挥着重要调控作用，其中就包括抵御细胞内病原体的入侵。在这一过程中，泛素（ubiquitin）的 C 末端通过泛素激活酶、结合酶和连接酶的级联反应，通常以异肽键的形式与底物赖氨酸的 ε - 氨基共价相连，偶尔也会连接到 N 末端或丝氨酸、苏氨酸侧链上。由于底物上连接的泛素还能在多个赖氨酸位点发生泛素化，进而形成不同连接类型的链，这些链赋予了修饰底物不同的命运。而去泛素化酶（DUBs）则可以特异性地切割泛素 C 末端形成的异肽键或肽键，使泛素和底物恢复到未修饰状态，为后续可能的再泛素化提供了条件。

尽管细菌自身并不具备泛素系统，但许多致病或共生细菌却进化出了针对泛素的效应子。这些效应子被分泌到宿主细胞内，通过干扰宿主的防御途径来增强细菌的适应性。比如，细菌泛素连接酶能够用 K48 或 K11 连接的泛素链修饰宿主蛋白，促使它们被蛋白酶体降解。另一方面，宿主细胞会利用自身的连接酶，将泛素安装在入侵细菌的表面或含有细菌的液泡（BCVs）表面。在没有细菌对抗措施的情况下，这些表面结合的泛素会将细菌颗粒靶向异噬作用，或者引导泛素化的 BCVs 向溶酶体降解。因此，具有细胞内生活方式的细菌进化出了多种逃避这种命运的机制，其中最突出的就是利用 DUB 效应子去除先前附着的泛素。

大多数细菌 DUBs 似乎是从宿主基因组中近期获取的，因为它们与真核 DUBs 在序列和结构上具有明显的相似性，并且通常局限于特定的细菌分类群。除了一个小的金属蛋白酶家族外，所有真核 DUBs 都是木瓜蛋白酶折叠半胱氨酸蛋白酶，可分为七个不同的类别（USP、UCH、OTU、Josephin、MINDY、ZUFSP 和 VTD）。大多数细菌 DUBs 要么与 OTU（卵巢肿瘤）家族相关，要么属于所谓的 CE 家族，该家族包含用于泛素样修饰剂 SUMO 和 NEDD8 的真核蛋白酶以及细菌去泛素化酶。典型的细胞内细菌如鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）、弗氏志贺氏菌（Shigella flexneri）、类鼻疽伯克霍尔德菌（Burkholderia pseudomallei）、肺炎衣原体（Chlamydia pneumoniae）和沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）通常编码一两种 DUBs，大多属于 OTU 或 CE 家族，且对连接特异性要求较低。不过，嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）和内盖夫希曼菌（Simkania negevensis）是两个例外，它们编码大量不同的 DUBs，其中一些对 K6 连接或线性链具有高度特异性。

最近研究发现，希曼菌属（Simkania）编码两个约瑟夫蛋白家族（Josephin family）成员，该家族此前被认为是真核生物特有的 DUB 类别。在对 SnJOS1 和 SnJOS2 的研究过程中，研究人员发现这两种酶具有一种不寻常的切割模式：当与泛素链孵育时，它们并非在泛素 C 末端后面切割异肽键，而是切割泛素中 Arg - 74 和 Gly - 75 之间的肽键。这种切割模式也会出现在单泛素中，导致泛素 C 末端缩短两个 Gly 残基，从而失去功能。这种被称为泛素 C 末端剪切酶（UCC）的活性，在许多（但并非全部）来自不同细菌门的细菌约瑟夫蛋白亲属中也能观察到。与之形成对比的是，真核约瑟夫蛋白在 Gly - 76 后面的经典 DUB 位置切割泛素。通过解析来自伯克霍尔德菌（Burkholderia pyrrocinia）的连接混杂型 UCC（BpJOS）和来自色素食酸菌（Pigmentiphaga aceris）的密切相关的常规 DUB（PaJOS）与底物结合的结构，研究人员确定了导致这种切割位置差异的结构基础。此外，还发现一些细菌 UCCs 具有连接特异性，如来自副衣原体属（Parachlamydia sp.）的 UCC（PcJOS）仅切割线性泛素链，这一特异性可通过分析 PcJOS 与线性二聚泛素的复合物结构来解释。总体而言，细菌约瑟夫蛋白家族的剪切酶使细菌能够将去泛素化转变为一个不可逆的过程。

结果

希曼菌属的约瑟夫蛋白是 UCCs

在对来自内盖夫希曼菌的细菌约瑟夫蛋白型 DUBs 进行表征时，研究人员发现它们对基于单泛素的模型底物 Ub - AMC 和 Ub - PA 没有活性，但对不同连接类型的二聚泛素具有活性。由于连接混杂型 DUBs 通常会与基于 AMC 或 PA 的模型底物发生反应，因此研究人员进一步探究了其链切割模式。SnJOS1 无法与 K63 连接的 diUb - VME 探针发生反应，这表明它对 Ub - AMC 和 Ub - PA 缺乏反应性并非是因为缺少近端（S1′）泛素部分。在分析 K63 二聚泛素的切割产物时，研究人员观察到除了预期的单泛素外，还有质量相差 ±114 Da 的峰，这一质量差异对应于泛素 C 末端的二甘氨酸肽，说明 SnJOS1 在两个泛素单元的 Arg - 74 之后进行了切割。通过使用内肽酶 AspN 对 SnJOS1 反应产物进行质谱分析，进一步证实了这一解释。当 SnJOS1 或 SnJOS2 与单泛素孵育时，也观察到了在 Arg - 74 之后的切割，导致底物末端的二甘氨酸缺失（Δ114 Da）。这种 UCC 活性在生理酶中从未被观察到，不过它与经过工程改造后也能作用于泛素的小核糖核酸病毒前导肽酶 Lb^pro的 ISG15 缩短活性类似。利用 Lys - ε - Gly - Gly 抗体监测 SnJOS1/2 对 K63 连接的 Ub₆₊的降解过程，可以检测到近端切割产物上的二甘氨酸残基，这表明两种希曼菌属的剪切酶都会随着时间推移使输入的链缩短，同时近端泛素上的 Lys - ε - Gly - Gly 积累。为了确认切割位置在 Arg - 74 之后，并探究 Ub - PA 缺乏反应性是否是由于非常规的切割位点，研究人员生成了一种缩短的基于活性的探针（Ub^1–73 - PA），用反应性炔丙胺弹头取代了 Arg - 74。结果发现，SnJOS1 和 SnJOS2 都只与 Ub^1–73 - PA 反应，而不与常规的 Ub^1–75 - PA 反应，这表明这些酶能够与基于活性的探针反应，但需要反应基团位于正确的位置。

具有不同切割活性的细菌约瑟夫蛋白家族

真核约瑟夫蛋白一直被认为是常规的 DUBs，尤其倾向于从丝氨酸和苏氨酸残基上去除泛素。研究人员通过实验验证了这一观点，发现人类的 ATXN3L 和 JOSD2 缺乏剪切酶活性。为了探究 SnJOS1/2 是特殊情况，还是细菌 UCC 家族的普遍特征，研究人员进行了生物信息学数据库搜索，寻找其他细菌约瑟夫蛋白同源物。通过广义轮廓搜索，研究人员在几种细菌的基因组中鉴定出了相关序列，包括伯克霍尔德菌（BpJOS）、卡塔琳伯克霍尔德菌（BcJOS）、色素食酸菌（PaJOS）、草螺菌属（Herbaspirillum sp.）（HeJOS）和副衣原体属（Parachlamydia sp.）（PcJOS）。研究人员在大肠杆菌中表达了这些酶的预测催化结构域，对其进行纯化，并表征了它们的催化特性。伯克霍尔德菌的约瑟夫蛋白 BpJOS 和 BcJOS 只与截短的 Ub^1–73 - PA 探针反应，表明它们具有剪切酶活性；而色素食酸菌的 PaJOS 则只与常规的 Ub^1-75 - PA 探针反应，这说明 UCC 活性并非细菌约瑟夫蛋白家族的普遍特征。通过完整质谱分析进一步确认了切割位置。另外两个候选蛋白 HeJOS 和 PcJOS 与两种探针均无反应，表明它们可能没有活性，或者需要特定的连接类型才能发挥作用。当将纯化的酶与 HEK293 细胞裂解物孵育，并用针对泛素或 Lys - ε - 二甘氨酸的抗体可视化产物时，结果与探针反应性数据相符。BpJOS 和 BcJOS 能够完全去除细胞中的泛素，并在底物上留下二甘氨酸残基；PaJOS 虽然能去除一些泛素，但不会产生二甘氨酸残基；HeJOS 与 PaJOS 类似，没有二甘氨酸产生，但高分子量（MW）链有所减少；PcJOS 在该实验中似乎没有活性，既没有观察到链的减少，也没有检测到抗体可识别的二甘氨酸残基。

研究人员使用一组不同连接方式的二聚泛素对这些酶的连接特异性进行了分析。伯克霍尔德菌的剪切酶 BpJOS 和 BcJOS 能够在几分钟内切割大多数链类型，但对 K27 连接的二聚泛素切割效果较差。相比之下，常规的 DUB PaJOS 对 K63 连接的链具有高度特异性，这凸显了细菌 JOS 家族内部的差异。对基于活性的探针无反应的 HeJOS 和 PcJOS，分别特异性地切割 K63 或 M1 连接的链。通过完整质谱分析 HeJOS 和 PcJOS 切割产生的单泛素，结果显示 HeJOS 产生的泛素质量为 8,558.6 Da，表明其为常规 DUB 切割；而 PcJOS 切割线性二聚泛素产生的泛素质量分别为 8,444.6、8,558.6 和 8,672.6 Da，这意味着远端泛素的 C 末端二甘氨酸被切割掉，而近端泛素的 N 末端则保留了二甘氨酸，同时也表明近端泛素的游离 C 末端很少被切割，强调了 PcJOS 活性对 M1 连接的要求。

BpJOS 作为一种连接混杂型剪切酶，其活性与经过工程改造后也能作用于泛素链的病毒前导肽酶 Lb^pro变体 Lb^pro?相似，不过 Lb^pro?对泛素链的切割没有连接选择性。研究人员比较了 BpJOS 和 Lb^pro对泛素和泛素样修饰剂的活性，发现 Lb^pro?能与剪切酶探针 Ub^1–73 - PA、NEDD8^1–73 - PA 和 ISG15^79–154 - PA 反应，而 BpJOS 只与泛素和 NEDD8 探针反应，其对 ISG15 的无活性通过完整质谱得到了证实。此外，BpJOS 对 K48 连接的二聚泛素的活性比 Lb^pro?高出几个数量级。

PcJOS 对 M1 特异性泛素剪切的结构基础

为了理解在连接特异性背景下 UCC 切割位点改变的结构基础，研究人员测定了 PcJOS 与其底物复合物的结构。他们将预测的活性位点残基 Cys - 162 突变为丙氨酸，使催化片段 PcJOS^70–324失去活性，然后将其与线性二聚泛素结晶，并将晶体结构解析到 2.18 ? 的分辨率。不对称单元中包含一个二聚泛素分子，由两个 PcJOS 分子结合，其中一个结合在泛素单元之间，另一个结合在二聚泛素的 C 末端。在第一个 PcJOS^70–324分子（链 A）中，97 - 324 区域完全解析，链 C 的构象与之几乎相同，均方根偏差（RMSD）为 0.44 ?，涉及 1,317 个原子。PcJOS 催化结构域包含一个类似于其他约瑟夫蛋白型 DUBs 的木瓜蛋白酶折叠核心结构域（α1 - β6）和一个由螺旋 α1′ - α3′形成的 N 末端延伸部分。活性位点由 Cys - 162（结构中为 Ala - 162）、His - 284 和 Asp - 300 组成，与基于序列比对的预测一致。在第一个 PcJOS 分子中，活性位点位于远端（S1）泛素的 Arg - 74 和 Gly - 75 之间的可切割肽键旁边，这与观察到的剪切酶活性相符。将任何一个活性位点残基突变为丙氨酸都会导致切割活性完全丧失。通过使用 DALI 进行结构数据库搜索，发现几个约瑟夫蛋白 DUBs 与 PcJOS 匹配度最高，包括人类的 JOSD2（PDB：6PGV）和 ATXN3L（PDB：3O65），这进一步支持了将 PcJOS 归为约瑟夫蛋白家族的分类。PcJOS 与真核约瑟夫蛋白的两个显著差异在于其延伸的 N 末端螺旋束（α1′ - α3′，残基 97 - 140）以及螺旋 α2/α3（残基 178 - 208）的主要构象差异。α2 螺旋比 ATXN3L 中的短，导致 α3 螺旋发生位移。在现有的 JOSD2 结构中，相应区域未被解析。有趣的是，这些区域分别与近端（S1′）和远端（S1）泛素单元有重要接触。

S1′泛素与 PcJOS（链 A）形成了广泛的氢键网络。在 N 末端延伸部分，Arg - 124 和 Asn - 127 分别与近端泛素的 Ser - 20′/Asp - 21′和 Asp - 58′形成氢键。其中，Arg - 124 的接触非常重要，因为 R124A 突变体几乎完全失去活性，而 N127A 突变则对活性没有影响。为了探究 N 末端区域是否通过空间位阻抑制其他链类型，从而导致 M1 连接特异性，研究人员测试了一种缺失该区域但保留了约瑟夫蛋白催化所需所有结构元件的 PcJOS 截短版本。结果发现，略微截短的 PcJOS^97–304仍能保持 M1 特异性切割，而缺失 N 末端延伸部分的 PcJOS^140–304对所有测试的二聚泛素物种和基于活性的探针均无活性。这表明，PcJOS 的 M1 特异性不太可能是由于对其他链类型的阻断，而更可能是由特定的线性链识别或底物辅助催化引起的。此外，环 275 - 278 也与 S1′泛素形成了额外的接触，其中 Tyr - 278 与 Asp - 32′形成氢键，Ala - 276 与近端泛素的 Ala - 28′和 Lys - 29′存在疏水相互作用。Y278A 突变体几乎没有活性，而 A28G 突变对活性没有影响，这表明 Tyr - 278 的接触对 S1′识别更为重要。除了这个环，还有几个残基与近端泛素接触，其中 Arg - 302 似乎最为重要，因为 R302A 突变体几乎没有活性，而 K304A 和 T157A 突变体仅略微降低活性。通过测试携带 E16′A 或 E18′A 点突变的二聚泛素，发现野生型 PcJOS 对这两种突变体均无法切割，这表明 Arg - 302 与 Glu - 16′和 Glu - 18′的侧链接触都很重要。总体而言，近端泛素似乎通过多种不同的相互作用被定位在可切割的构象中。

在 S1 位置的相互作用包括 α2/α3 区域对疏水 Ile44 - 补丁的识别以及泛素 C 末端靠近可切割键处的几个极性相互作用。泛素 Ile - 44 与 PcJOS 的 Met - 195 接触，而补丁周围的残基（Val - 70、His - 68 和 Leu - 8）与 PcJOS 的 Leu - 193、Val - 216 和 Phe - 189 存在疏水相互作用。单独通过突变 M195A、L193A、V216A 或 F189A 消除这些相互作用，会适度降低活性，而双突变体 F189A/L193A 则完全没有活性。此外，Asp - 213 与 Leu - 71 主链之间的氢键也至关<重要，因为 d213a 突变体没有活性。大多数 dubs 通过泛素的 arg - 72 和 arg - 74 与酶的酸性或其他极性残基之间的盐桥和 或氢键来识别和定位可切割的泛素 c 末端。在 pcjos 结构中，arg - 72 和 arg - 74 分别与 asp - 209 和 asp - 208 接触。然而，这些残基的突变（d208a、d209a 和 d208a d209a）仅略微降低二聚泛素的切割。与其他 dubs 不同，arg - 72 和 arg - 74 不仅与 asp - 208 asp - 209 的侧链羧基结合，还与它们的主链羰基结合，而后者不受突变影响。使用 r72a 和 r74a 突变的泛素底物进行的实验支持了这一解释，这些底物大多对 pcjos 切割呈惰性，证明了这两个精氨酸残基对活性的重要性。此外，还观察到 arg - 282 与泛素 gln - 40 以及 thr - 265 与泛素 pro - 37 之间的相互作用，但这些相互作用似乎并不关键，因为 t265a 和 r282a 突变体的活性与野生型 pcjos 几乎相同。在具有常规切割模式的 dubs 中，催化组氨酸残基通常后面跟着一个芳香族 “守门” 残基，该残基与 gly - 75 相互作用，除其他功能外，还限制了在该位置没有小氨基酸的底物进入活性位点。在 uccs 中，由于在 arg - 74 之后切割，理论上不需要这样的守门作用。然而，本研究中鉴定的许多剪切酶确实保留了芳香族残基。在 pcjos 中，催化 his - 284 后面跟着 phe - 285，它与切割位点前的 leu - 73 接触。为了研究这种相互作用的重要性，研究人员测试了 “守门残基” 及其相互作用伙伴的突变。结果表明，f285a 突变体的活性被消除，l73a>

剪切酶型切割的结构决定因素

细菌约瑟夫蛋白家族同时包含剪切酶和常规 DUBs，这就引出了一个问题：切割位置是如何确定的。来自伯克霍尔德菌（Burkholderia pyrrocinia）的 BpJOS（UCC）和来自色素食酸菌（Pigmentiphaga aceris）的 PaJOS（DUB）是特别有趣的研究对象，因为它们密切相关但切割模式不同。对于常规切割的 PaJOS，研究人员将其催化片段 PaJOS^2–265与 Ub - PA 结晶形成共价复合物，并将结构解析到 1.89 ? 的分辨率。不对称单元包含十二个 PaJOS/Ub 复合物，它们几乎相同，均方根偏差（RMSD）在 0.1 到 0.3 ? 之间。总体而言，该结构揭示了一个类似约瑟夫蛋白的木瓜蛋白酶折叠（α1 - β6），带有一个由单个螺旋 α1′组成的 N 末端延伸部分。活性位点残基被确定为 Cys - 66、His - 187 和 Asp - 203，这证实了基于序列的预测。将任何一个活性位点残基突变为丙氨酸都会导致切割活性丧失。对于混杂型剪切酶 BpJOS，研究人员将催化失活的全长蛋白 BpJOS^C69A与线性二聚泛素结晶，并将结构解析到 2.56 ? 的分辨率。不对称单元包含两个 BpJOS / 泛素复合物，每个复合物在 S1 位置仅包含一个泛素部分。电子密度表明，可见的与 S1 结合的泛素对应于二聚泛素底物的 C 末端单元，而 N 末端单元由于缺乏明确的界面而无序。在两个 BpJOS 链中，15 - 218 位残基被解析，它们的构象几乎相同，均方根偏差为 0.2 ?，涉及 1,308 个原子。解析出的区域对应于 BpJOS 的最小活性片段，因为进一步截断 N 末端 α 螺旋和前两个 β 链（在 PaJOS 中不保守）会导致活性完全丧失。总体而言，BpJOS 结构揭示了一个类似约瑟夫蛋白的木瓜蛋白酶折叠，其核心（α1 - β5）与 PaJOS 相似，但前面有一个独特的 N 末端，由一个螺旋和两个 β 链（α1′ - β2′）组成。活性位点残基被鉴定为 Cys - 69（结构中为 Ala - 69）、His - 166 和 Asp - 182，将它们分别替换为丙氨酸会普遍消除活性。

根据序列相似性，PaJOS 和 BpJOS 的催化结构域可以以 1.29 ? 的均方根偏差在 522 个原子上进行叠加。然而，结合的 S1 泛素分子不能叠加，因为它们以不同的取向结合，最终导致其 C 末端的位移，从而产生不同的切割位置。泛素结合的差异似乎是由蛋白酶结构的细微变化引起的。两种酶都通过与 PaJOS 中的 α2/η1/α3 和 BpJOS 中的 α2/α3/α4 对应的同源区域结合 S1 - 泛素的 Ile - 44 补丁，但这些区域的序列保守性较差且结构差异较大。在 BpJOS 中，该区域形成刚性螺旋结构，并通过 Val - 96、Leu - 98 和 Phe - 116 与 Ile - 44 补丁接触。在这里，α3 螺旋提供刚性，但不直接与泛素接触。相比之下，PaJOS 的相应区域更灵活，α2 由短螺旋 η1 延伸，并通过无序环与 α3 连接。泛素 Ile - 44 补丁由 Phe - 96、Ile - 97 和 Leu - 104 接触。对这些疏水残基的突变分析表明，对于两种酶来说，泛素切割都高度依赖于这些接触。Ile - 44 识别区域的结构差异可能导致结合的泛素取向不同。除了其他空间位阻问题，BpJOS 结合的 S1 泛素会与 PaJOS 的 η1 发生冲突。

为了研究两种泛素结合模式在其他约瑟夫蛋白 UCCs 和 DUBs 中是否保守，研究人员比较了现有的两种剪切酶结构 BpJOS 和 PcJOS，它们的催化结构域可以以 2.36 ? 的均方根偏差在 619 个原子上进行叠加。结果显示，BpJOS 和 PcJOS 的 α3 螺旋位置保守，结合的泛素取向几乎相同。相反，常规切割的 PaJOS 和真核 DUB ATXN3L 都使用它们的 α2 螺旋（各自延伸一个短的 η1 螺旋）来定位 S1 泛素，以便进行 DUB 切割。总体而言，现有数据表明，约瑟夫蛋白型 UCCs 以保守的方式使用催化半胱氨酸后面的螺旋来定位 S1 泛素进行剪切酶切割，而细菌约瑟夫蛋白型 DUBs 则与其真核对应物相似。PaJOS 和 BpJOS 都有第二个泛素结合界面与 Ile - 36 补丁接触。在 PaJOS 中，His - 116 和 Ile - 142 与 S1 泛素的 Thr - 9、Ile - 36、Pro - 37 和 Leu - 71 进行疏水相互作用。在 BpJOS 中，His - 212 与泛素的 Ile - 36 相互作用。在这两种情况下，这些相互作用对充分发挥活性都很重要，突变分析证明了这一点。由于泛素取向不同，PaJOS 和 BpJOS 中 Ile - 36 的识别涉及不同区域。虽然 PaJOS 和 ATXN3L 之间保守了典型的 DUB 对 Ile - 36 的识别，但在两种可用的剪切酶结构中，UCC 取向的识别有所不同。在 BpJOS 中与 Ile - 36 接触的环在 PcJOS 中较短，取而代之的是来自相邻环的 Ile - 263 与泛素中的 Leu - 71 接触。尽管接触残基的序列位置不同，但它们占据相似的空间，导致结合的泛素取向保守。

由于 UCCs 结合的泛素 C 末端相对于 DUBs 偏移了两个残基，预计在定位泛素尾部方面会有重大差异。在 PcJOS 中，Arg - 72 和 Arg - 74 通过与主链原子的氢键至关重要地稳定下来，BpJOS 中也观察到类似的结合模式。泛素的 Arg - 74（紧接在可切割键之前的残基）与 BpJOS 的 Asp - 65、Leu - 108 和 Gln - 109 的主链原子形成强氢键，另一个氢键存在于泛素的 Arg - 72 和 BpJOS 的 Asp - 110 之间。因此，线性 R74A 二聚泛素几乎不被 BpJOS 切割，而 R72A 取代对切割没有明显影响。Leu - 73（Arg - 72 和 Arg - 74 之间的疏水残基）与 BpJOS 的 Trp - 167（和 PcJOS 的 Phe - 285）接触，对催化至关重要。在常规切割且偏好 K63 的 PaJOS 中，泛素的 Arg - 74 也通过主链氢键稳定，但与蛋白酶的不同区域（Pro - 106 和 Ser - 111）结合。Arg - 72 没有显示出强相互作用。因此，PaJOS 与 R72A - PA 反应，而与 R74A - PA 的反应则受到强烈损害。与 BpJOS 不同，PaJOS 不与 Leu - 73 相互作用，这似乎是剪切酶特有的要求。相反，芳香族守门残基 Phe - 188 稳定 Gly - 75，这在常规 DUBs 中很常见。F188A 突变对二聚泛素切割的影响较小。UCCs 和常规 DUBs 不同的泛素结合模式引发了一个问题：是否可以通过交换各自的泛素识别区域来改变切割类型。假设通过剪切酶的 α2/α3 和 DUBs 的 α2/η1 对 Ile44 补丁的识别是最关键的决定因素，研究人员在 BpJOS 和 PaJOS 之间交换了这些区域以创建嵌合酶。然而，当试图通过将 PaJOS 的 82 - 112 位残基替换为 BpJOS 的 84 - 110 位残基将其转换为剪切酶时，没有获得折叠的蛋白质。相反，当将 BpJOS 的 84 - 110 位残基替换为 PaJOS 的 82 - 112 位残基时，嵌合蛋白 dBpJOS 可以纯化，但没有酶活性。研究人员认为 Ile - 36 补丁识别可能也很重要，并且交换的螺旋可能需要结构其余部分的特定支持。由于 PaJOS 缺乏构建剪切酶型 Ile36 识别的结构支架，第二个嵌合构建体专注于将 BpJOS 转换为正常的 DUB。BpJOS 的 α2 的最后两个残基和完整的 α3 被 PaJOS 的相应区域取代，此外，Asn - 115 突变为 His 以创建类似 DUB 的与泛素 Leu - 8 的接触，His - 212 突变为 Ala 以去除 UCC 对 Ile - 36 的识别，Ala - 134 突变为 Ile 以引入类似 DUB 的对 Ile - 36 补丁的结合。然而，所得的 dBpJOS - II 嵌合体仍然完全没有活性。研究人员推测另一个问题可能是嵌合体中泛素 C 末端的稳定不足。剪切酶 BpJOS 特异性识别 S1 泛素的 Arg - 74，但不识别 Arg - 72。在将 BpJOS 工程改造为常规 DUB 后，Arg - 74 将占据 Arg - 72 的位置且无法稳定。为了解决这个问题，研究人员生成了嵌合体 dBpJOS - II 与泛素复合物的 AlphaFold 模型，并设计了一些（单个）突变（G76D、G76E、A110D 或 A110E），这些突变可能以 DUB 模式稳定 Arg - 74。然而，生成的嵌合体都没有显示出任何活性。因此，交换 UCC 和 DUB 活性似乎并不简单，可能需要对泛素结合表面及其支持结构进行广泛的重新设计。

切割位置的可预测性

在已描述的细菌约瑟夫蛋白中，有四个连接混杂型 UCCs、一个 M1 特异性 UCC 和两个常规切割的 DUBs。为了扩展对剪切酶的认识，寻找其他连接特异性，并测试结构建模是否可以预测切割模式，研究人员进行了全面的生物信息学搜索以寻找候选蛋白。他们选择了八个代表性蛋白质进行实验验证（PtJOS、KrJOS、MtJOS、MxJOS、ScJOS、MlJOS、Pc2JOS 和 CsJOS）。通过对催化结构域与泛素的复合物进行 AlphaFold 建模，获得了七个合理的模型，其中 KrJOS 产生的模型复合物置信度得分较低（iptm + ptm < 0.35）。将所得模型与剪切酶（BpJOS）和 DUB（PaJOS）的泛素结合结构进行叠加，发现只有 MxJOS 的泛素呈 DUB 典型排列，而其他六个模型显示出剪切酶取向的 S1 泛素。

对于所有八个候选蛋白，研究人员在大肠杆菌中表达其催化结构域，进行纯化，并测试其切割模式和可能的连接特异性。KrJos 由于没有令人信服的 AlphaFold 模型，表达不佳，并且不与 UCC 特异性探针 Ub^1–73 - PA 或 DUB 特异性 Ub^1–75 - PA 反应。对于具有高置信度复合物模型的候选蛋白，实验确定的切割模式与基于结构的预测相符：MxJOS 仅与常规 Ub^1–75 - PA 反应，而 MtJOS、PtJOS、ScJOS、MlJOS 和 Pc2JOS 仅与剪切酶探针 Ub^1–73 - PA 反应。所有这些酶对各种连接类型的二聚泛素都没有太多选择性地进行切割。相比之下，来自衣原体目细菌 ST3 的 CsJOS 不与任何探针反应，仅特异性地切割线性二聚泛素。由于连接特异性 DUBs 通常不与探针反应，研究人员通过完整质谱分析了 CsJOS 对 M1 连接的二聚泛素的消化，发现它以剪切酶模式切割，与结构模型的预测一致。

讨论

细胞内细菌利用多种效应子来对抗宿主基于泛素的防御机制。除了可以逆转宿主 E3 连接酶作用的 DUBs 外，还有其他类型的效应子，如可以阻止连接酶接触细菌的蛋白、使细菌表面赖氨酸甲基化的酶、通过脱酰胺作用损害宿主泛素的蛋白，以及通过将宿主 E2 酶与泛素交联来破坏它们的物质。UCCs 是细菌武器库中的新成员，它将不需要的靶标的去泛素化与修饰剂的不可逆破坏以及修饰位点免受重新修饰的保护相结合。研究人员在多种细菌门中鉴定出了约瑟夫蛋白型剪切酶，包括变形菌门、衣原体门、粘球菌门、酸杆菌门和蓝细菌门，但它们在这些门中的存在仅限于少数物种，主要的人类病原体中并不存在。乍一看，剪切酶效应子似乎是细菌颠覆宿主基于泛素的防御的理想选择，但为什么更多的细菌不使用剪切酶而使用常规 DUBs 呢？一种可能的解释是，许多细菌依赖泛素连接酶活性，而大规模破坏泛素可能对它们不利。此外，长时间维持高剪切酶活性可能会通过耗尽功能性泛素和 / 或通过功能失调的截短泛素堵塞泛素识别组件而具有细胞毒性。在编码剪切酶的细菌中，只有内盖夫希曼菌已被证明可以感染人类细胞，但在感染期间 SnJOS1 和 SnJOS2 的表达水平非常低，并且这两种酶的活性相当温和。另一方面，来自伯克霍尔德菌的高活性 BpJOS 偶尔在囊性纤维化患者中发现，但目前缺乏感染模型。

细菌约瑟夫蛋白家族的剪切酶是唯一具有泛素定向剪切（UCC）活性的天然存在的酶。口蹄疫病毒（FMDV）的前导肽酶 Lb^pro除了切割病毒多聚蛋白外，还在末端 GlyGly 之前切割泛素样修饰剂 ISG15。基于 Lb^pro，一种变体酶 Lb^pro?被设计出来，它显示出降低的修饰剂特异性，包括对泛素和 NEDD8 的作用。然而，其 UCC 活性仍然比 BpJOS 低几个数量级。与单一的 Lb^pro不同，细菌剪切酶属于一个扩展的家族，既包含 UCC 成员，也包含 DUB 成员。这种有利的情况使得研究人员能够研究将切割位点移动两个位置所需的结构变化。至少在约瑟夫蛋白家族中，关键因素是结合的 S1 泛素的取向，其 Ile - 44 补丁由位于木瓜蛋白酶折叠的螺旋（α1）和第一个 β 链之间的可变 α2/α3/α4 区域识别。现有的 UCC 和 DUB 结构在该区域有显著差异，导致泛素取向明显不同。有趣的是，α2/α3/α4 区域在不同的剪切酶之间在序列和（预测的）结构上显示出相当大的可变性，而结合的 S1 泛素的取向<预测更为保守，并且被发现能高度准确地预测实验确定的切割模式。有趣的是，m1 特异性的 pcjos 和 csjos 证明了约瑟夫蛋白家族剪切酶中存在连接特异性，尽管切割位点和连接位点在空间上是分离的。对 pcjos 和 bpjos 与线性二聚泛素复合物结构的直接比较揭示了观察到的连接特异性差异的基础。在 pcjos 中，近端 m1 连接的泛素通过广泛的 s1′相互作用网络被识别。相比之下，bpjos 结构中的近端泛素完全无序，这可能是由于缺乏 s1′识别界面，这与 bpjos>

除了对 DUB 进化和细菌防御机制的深入了解外，约瑟夫蛋白型剪切酶还为研究泛素系统提供了实验途径。工程化的多 UBL 剪切酶 Lb^pro?已成功应用于研究分支泛素链。用剪切酶处理后，每个泛素化位点会在赖氨酸残基上留下一个二甘氨酸残基，可以使用质谱法进行识别。对于泛素而言，在单个泛素单元上检测到多个残基证明了分支的存在，并能够对其进行量化。然而，Lb^pro?无法区分泛素化、NEDDylation 和 ISGylation，因为它对所有这些修饰的切割效果相同。此外，由于 Lb^pro?源自一种生理性的 deISGylase，它对泛素连接类型没有特异性，因此无法提供有关链分支性质的信息。细菌 UCCs 可能是解决这些局限性的关键。BpJOS 是一种高活性的泛连接 UCC，它完全不影响 ISGylation 位点，能够区分免疫刺激下同时出现的泛素和 ISG15 衍生的二甘氨酸残基。由于 BpJOS 也以剪切酶模式切割 NEDD8 修饰，目前的形式无法用于区分泛素化和 NEDDylation 位点。然而，本文提供的结构数据应该有助于设计修饰剂特异性的剪切酶。细菌约瑟夫蛋白型剪切酶的另一个独特优势是存在连接特异性的酶。在本研究中表征的 11 种 UCCs 中，有 5 种是高活性的连接混杂型酶，2 种是严格的 M1 特异性酶，其余的则表现出适度的连接偏好但没有真正的特异性。目前的蛋白质数据库包含几十种额外的 UCC 候选蛋白，并且不断有更多的细菌序列被添加进来。现有的序列和结构多样性将有助于识别和设计具有新特异性的剪切酶。

研究的局限性

本文描述的酶的生理靶点及其与发病机制的相关性仍然未知。研究人员只能推测为什么 UCCs 存在于少数宿主相关细菌中，而在重要的医学细菌病原体中却不存在。虽然可能存在更多具有 UCC 活性的酶，但 UCC 活性可能对细菌的某些适应性方面有害。这些问题需要进一步研究。结构数据和诱变实验表明，UCC 相对于常规约瑟夫蛋白型 DUBs 的切割位置变化是由对远端（S1）泛素的不同识别引起的。这种偏好编码在催化结构域的一个短可变区域内，像 AlphaFold 这样的结构预测程序可以准确预测 UCC/DUB 活性。然而，通过交换可变区域来重新设计切割位置的尝试失败了，这可能是由于缺乏足够的结构稳定性来正确定位改变的识别环。但也可能存在其他尚未完全理解的影响切割位置的因素。

资源可用性

进一步的信息以及对资源和试剂的请求应联系主要联系人 Kay Hofmann（kay.hofmann@uni - koeln.de）。本研究中产生的所有试剂将根据要求提供，但如果存在商业应用的潜力，可能需要支付费用和 / 或签署材料转移协议。所有 X 射线结构已存入 PDB 数据库，登录号分别为 PDB：9F5T（BpJOS）、9FN4（PcJOS）、9FPA（PcJOS，正交晶系）和 9G7G（PaJOS）。之前发布的结构 6PGV 和 3O65 也可从 PDB 获得。质谱的原始数据已存入 ProteomeXchange 数据库，登录号为 PXD058333。本研究结果的源数据已存入 Mendeley Data，可从https://doi.org/10.17632/ggcmfjns65.1获取。所有存入的数据将在出版之日起公开。本文未报告原始代码。任何重新分析本文数据所需的额外信息可应要求从主要联系人处获得。

致谢

研究人员感谢 Christiane Horst 提供的技术支持。这项工作得到了德国研究基金会（DFG，grant HO 3783/3 - 2 to K.H.）和荷兰科学研究组织（NWO，VIDI Grant VI. 213.110 to M.P.C.M）的支持。晶体生长使用了科隆结晶设施（C2f）的设备，该设施由 DFG Grant Inst 216/949 - 1 FUGG 资助。同步辐射数据在瑞士光源（Paul Scherrer Institute，瑞士）的 X06SA 光束线、欧洲同步辐射设施（ESRF，法国）的 ID23_2 光束线以及德国汉堡 EMBL 外站 PETRAIII 的 P13 光束线收集。研究人员感谢这些机构的工作人员提供的支持。同时也感谢 CECAD 蛋白质组学设施（由 DFG Grant Inst 216/1163 - 1 FUGG 资助）进行的蛋白质组数据分析。

作者贡献

T.H. 和 S.K. 进行了所有的生化和结晶实验。M.U. 收集了 X 射线数据并解析了结构。U.B. 指导了晶体学工作。R.A.d.H. 和 M.P.C.M. 设计并合成了基于活性的探针。K.H. 构思并监督了该项目，并进行了生物信息学分析。所有作者都对论文做出了贡献。

利益冲突声明

作者声明不存在利益冲突。

STAR★Methods

关键资源表

研究中使用的抗体包括抗泛素抗体（Millipore，Cat#05 - 944；RRID:AB_441944）、抗二甘氨酰赖氨酸抗体（Lucerna，Cat#30 - 0100）、抗 β - 肌动蛋白抗体（Santa Cruz，Cat#sc - 81178；RRID:AB_2223230）等；细菌和病毒菌株有大肠杆菌 DH5α（ThermoFisher，Cat#EC0112）、大肠杆菌 Rosetta?(DE3) pLysS（Novagen，Cat#70956）等；使用的化学物质、肽和重组蛋白有 K6 连接的二聚泛素（Biomol GmbH，Cat#SBB - UP0060 - C025）、K29 连接的二聚泛素（Biomol GmbH，Cat#SBB - UP0077 - C025）等；还包括各种实验模型（如 HEK293T 细胞系，ATCC: CRL - 3216）、寡核苷酸、重组 DNA 以及众多软件和算法（如 MAFFT v7.505、Pftools v3 等）。

实验模型和研究参与者细节

DH5α 大肠杆菌（ThermoFisher）用于所有的克隆和质粒繁殖，Rosetta?(DE3) pLysS 大肠杆菌（Novagen）用于所有重组蛋白的表达。所有大肠杆菌菌株在含有适当抗生素的 LB 培养基中于 37°C 培养。

方法细节

序列分析使用 MAFFT 软件包进行序列比对，用 pftools3 从多序列比对中生成广义轮廓，并使用 pfsearchV3 在 UniProt 数据库和 NCBI 微生物基因组参考序列数据库中进行搜索。HMM - to - HMM 搜索使用 HHSEARCH 方法。所有结构预测使用本地安装的 Alphafold 2.3 进行，结构比较则使用 DALI 软件。

克隆与诱变方面，除 SnJOS2 外，所有细菌约瑟夫蛋白 DUBs 的编码区域通过基因合成（IDT）获得，并使用 In - Fusion HD 克隆试剂盒（Takara Clontech）克隆到 pOPIN - S 载体中。SnJOS2 从内盖夫希曼菌基因组 DNA 扩增并相应克隆。密码子优化的二聚泛素和 Lbpro^?通过基因合成获得并分别克隆到 pOPIN - B 和 pOPIN - K 载体中。DUB/UCC 嵌合体通过计算机设计、基因合成后克隆到 pOPIN - S 载体中。点突变使用 QuikChange Lightning 试剂盒（Agilent Technologies）引入。

蛋白质表达与纯化过程中，细菌和人类约瑟夫蛋白从 pOPIN - S 载体表达，带有 N 末端 6His - SMT3 标签。ISG15^{79 - 165}、泛素和 Lb^pro?分别从 pOPIN - B 和 pOPIN - K 载体表达，带有 N 末端 6His 标签或 6His - GST 标签。大肠杆菌（Rosetta (DE3) pLysS）用相应构建体转化，在 LB 培养基中 37°C 培养至 OD₆₀₀为 0.8，冷却至 18°C 后用 0.1 mM IPTG 诱导蛋白表达。硒代蛋氨酸取代的 PcJOS 的表达在 M9 基本培养基中进行，补充相关氨基酸和维生素，达到一定 OD 值后添加反馈抑制氨基酸混合物、IPTG 并降温。培养 16 h 后收获细胞，经冻融、裂解、离心澄清后，用 HisTrap FF 柱进行亲和纯化，去除标签后透析，再经第二轮亲和纯化和尺寸排阻色谱纯化，最后浓缩、冻存。

基于活性的探针的酶促生成中，野生型 Ub^{1 - 75} - PA、R72A / R74A 突变体和 ISG15^{79 - 154} - PA 作为 C 末端内含肽融合蛋白表达，经亲和纯化、珠上切割、反应合成和色谱纯化后获得探针。化学合成活性探针时，Ub^{1 - 73}和 Nedd8^{1 - 73}在自动化肽合成仪上通过标准 Fmoc - 固相肽化学合成，再经一系列反应和纯化步骤得到 Ub^{1 - 73} - PA 和 Nedd8^{1 - 73} - PA。

链生成方面，未标记的 Met1 连接的二聚泛素和带 His 标签的 Met1 连接的二聚泛素及其突变体通过表达和色谱纯化获得。K11、K48 和 K63 连接的泛素链通过相应的 E1、E2 和泛素在反应缓冲液中孵育 18 h 生成，再经阳离子交换色谱分离不同长度的链。

完整质量分析在蛋白质组学设施中进行，样品经色谱分离后用质谱仪检测，数据用 mMass 5.5 软件进行处理和分析。

结晶实验中，催化失活的 PcJOS（± 硒代蛋氨酸取代）、线性连接的二聚泛素、PaJOS 与 Ub - PA 复合物、催化失活的 BpJOS 与线性连接的二聚泛素分别按特定比例混合，使用坐滴气相扩散法在商业稀疏矩阵筛选条件下结晶，优化结晶条件后收获晶体。

数据收集、相位确定、模型构建和精修过程中，所有衍射数据用 XDS 处理，分子置换结构解析使用 PHASER，精修通过 phenix.refine 和 refmac 进行，模型构建使用 COOT 程序。PcJOS 的四方晶型用于硒代蛋氨酸相位确定，正交晶型通过分子置换法解析；PaJOS 和 BpJOS 的结构分别通过分子置换法，利用 AlphaFold 预测模型和相关搜索模型解析。

活性探针分析实验中，DUBs 或 UCCs 与基于活性的探针在反应缓冲液中孵育 18 h，反应停止后用 SDS - PAGE 和考马斯亮蓝染色分析。

泛素链切割实验中，DUBs 在特定缓冲液中稀释后与不同的二聚泛素或 Ub6 + 链在 20°C 孵育，反应停止后通过 SDS - PAGE 分析，或转移到 PVDF 膜上进行 western blotting 检测。

细胞培养和 western blotting 实验中，HEK293T 细胞在特定条件下培养，收获后裂解，调整蛋白浓度后与相应酶孵育，反应停止后进行 SDS - PAGE 和 western blotting 检测，使用多种抗体进行检测，最后用化学发光试剂显色，用 ImageLab 软件获取凝胶图像。

用于切割位点确定的自下而上蛋白质组学实验中，Lys63 连接的二聚泛素链与 SnJOS1 孵育，经一系列处理后进行蛋白质消化，肽段纯化后用质谱仪分析，数据用 MaxQuant 1.6.12.0 和 Skyline 软件分析。

量化和统计分析方面，完整质谱数据使用 mMass 软件 v5.5 进行量化，本文未进行统计分析。

补充信息

本文提供了多个补充文件，包括包含 Figures S1 - S6 和 Tables S1 - S4 的 PDF 文件、包含质粒、引物和 gBlocks 信息的 Excel 文件以及包含文章和补充信息的 PDF 文件，这些补充信息为研究提供了更详细的数据和方法等内容。