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研究人员为提高秘鲁长春花（Thevetia peruviana）次生代谢产物产量，开展相关研究，发现固定化及激素处理可提升其产量，意义重大。
研究背景：探索植物细胞培养的宝藏
在植物的奇妙世界里，秘鲁长春花（Thevetia peruviana）是一种极具魅力的观赏灌木。它原产于中美洲，不仅有着美丽的外表，更蕴含着巨大的药用潜力。从医学角度来看，秘鲁长春花中的次生代谢产物，如强心苷（Cardiac glycosides，CG）、酚类化合物（Phenolic compounds，PC）和黄酮类化合物（Flavonoids，Fv），具有多种生物活性，可用于治疗心脏疾病、对抗癌症、抵抗病毒，还能发挥抗氧化和抗菌作用。例如，其所含的 Peruvoside 能够抑制肺癌细胞的增殖、侵袭和迁移，还具有广谱抗病毒活性。
然而，获取这些珍贵的次生代谢产物并非易事。传统的植物提取方法面临诸多挑战，当植物未被驯化、生长缓慢，或者目标分子浓度极低且不稳定时，传统方法难以满足需求。尽管此前已建立了秘鲁长春花的悬浮细胞培养体系，但要进一步提高次生代谢产物的产量，仍需探索新的技术手段。于是，科研人员将目光投向了细胞固定化和诱导子技术，试图开辟一条高效获取药用次生代谢产物的新途径。
研究机构与目标：哥伦比亚科研团队的探索之旅
为了解决上述问题，来自哥伦比亚国立大学、大西洋大学和 EIA 大学的研究人员携手合作。他们开展了一项极具创新性的研究，旨在构建秘鲁长春花细胞的海藻酸钙固定化培养体系，并探究茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）和水杨酸（Salicylic acid，SA）对该体系中细胞生物量以及次生代谢产物（PC、Fv 和 CG）生产的影响。研究人员提出假设，将细胞固定化与植物激素诱导相结合，或许能够促进特殊代谢产物的生物合成，并使其更易释放到生长培养基中。这项研究成果发表在《Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC)》上。
研究方法：开启科研探索的钥匙
研究人员采用了多种关键技术方法。首先，他们建立了秘鲁长春花的游离悬浮细胞培养体系，并从果实中获取细胞。随后，利用海藻酸钠和氯化钙将处于指数生长期的细胞固定化，制成海藻酸钙微球。在培养过程中，定期测定固定化细胞的生物量（包括微球内和微球外的生物量）。在细胞培养的第 8 天，分别添加 3μM 的 MeJA 和 300μM 的 SA 进行诱导处理，并在诱导后的不同时间点（24 - 120 小时）收获细胞，测定生物量和次生代谢产物的含量。采用分光光度法测定 PC、Fv 和 CG 的含量，通过高效液相色谱 - 二极管阵列检测器（HPLC - DAD）分析代谢产物谱。最后，运用统计学方法对数据进行分析，确定不同处理之间的差异。
研究结果：技术带来的惊喜发现
- 细胞固定化的影响：成功制备出海藻酸钙微球，固定化细胞的初始生物量为 0.70±0.14 g DW/L。在 20 天的培养过程中，微球内生物量在第 10 天达到最大值 7.25±0.50 g DW/L，微球外生物量在第 20 天达到峰值 1.20±0.04 g DW/L。与游离细胞培养相比，固定化培养的生物量浓度较低，这可能是由于营养物质和氧气扩散受限。但固定化显著提高了次生代谢产物的产量，在第 9 - 10 天，PC、Fv 和 CG 的细胞内浓度分别增加了 1.41 倍、9.56 倍和 1.27 倍，Fv 和 CG 的细胞外浓度也有所提高。
- MeJA 和 SA 对生物量的影响：在指数生长期添加诱导子后，SA 处理的培养物在 48 小时后生物量显著降低，表明固定化细胞对该培养条件耐受性较低。MeJA 处理在 72 小时后生物量才显著下降，这可能与 MeJA 抑制细胞有丝分裂周期，使细胞停滞在 G1 期有关。
- MeJA 和 SA 对次生代谢产物的影响
- 酚类化合物（PC）：固定化且诱导处理的培养物中，细胞内 PC 含量逐渐增加，MeJA 处理在 72 小时达到最大值，SA 处理在 24 小时达到最大值。细胞外 PC 浓度在 SA 处理 48 小时后最高，这表明 PC 能有效扩散到细胞外，简化了后续的纯化过程。
- 黄酮类化合物（Fv）：SA 处理显著促进了 Fv 的生物合成，细胞内浓度在 24 小时达到最大值，细胞外浓度在 72 小时达到最大值。MeJA 处理对细胞内 Fv 积累影响较小，在细胞外 96 小时 Fv 含量最高。
- 强心苷（CG）：SA 处理在 120 小时后显著提高了细胞内 CG 浓度，可能是由于细胞在微球内生长导致 CG 扩散受限。MeJA 处理未显著增加细胞内 CG 浓度，但细胞外 CG 浓度在整个培养期均高于对照组。
- HPLC - DAD 分析结果：通过 HPLC - DAD 在不同波长下分析发现，SA 处理增加了在 220nm 处有强吸收的化合物的生物合成，MeJA 和 SA 处理均促进了在 360nm 处有吸收的化合物的产生，且二者对不同保留时间的化合物的诱导作用存在差异。
研究结论与意义：为植物细胞培养指明方向
这项研究表明，将秘鲁长春花细胞固定在海藻酸钙微球中，并使用 SA 和 MeJA 诱导，能够有效提高 PC、Fv 和 CG 的细胞外水平，为建立无需细胞裂解的连续生产过程奠定了基础。然而，目前对于植物激素和固定化基质对相关生物合成基因表达以及膜转运蛋白生物合成的协同作用，仍有待进一步研究。未来的研究应聚焦于优化 SA 诱导条件以提高生物量，优化细胞固定化条件，同时运用更先进的技术鉴定化合物。这不仅有助于推动秘鲁长春花细胞培养技术的发展，使其成为生产高价值代谢产物的可扩展平台，还能促进绿色生物技术在工业生产中的应用，降低成本，减少对合成替代品的依赖，为生物技术和制药行业创造新的经济机遇。
