综述：卵巢组织冷冻保存（OTC）的研究进展

本文综述了卵巢组织冷冻保存（OTC）技术，涵盖其原理、方法、优势与局限及在多种哺乳动物中的进展。

　　### 卵巢组织冷冻保存（OTC）的研究进展
在生命科学和医学领域，低温生物学如同一位神奇的 “时光守护者”，它借助制冷技术和低温工程设备，按照生物学、医学、兽医学以及动物科学等不同领域的特殊需求，实现对生物活体材料的保存与应用。在生殖生物学这片充满奥秘的领域中，低温生物学的影响力更是不容小觑，尤其是卵巢组织冷冻保存（Ovarian Tissue Cryopreservation，OTC）技术，为众多领域带来了新的希望与挑战。

1. OTC 概述

OTC 是辅助生殖技术领域中一颗冉冉升起的新星。它主要是将含有大量卵母细胞的原始卵泡和初级卵泡所在的卵巢皮质进行冷冻保存。这一过程就像是给卵巢组织按下了 “暂停键”，让其中的体细胞和生殖细胞的结构完整性得以维持。卵巢组织的来源十分广泛，可以从处于不同发育阶段（成年、青春期前、胎儿期）以及不同状态（存活、死亡）的动物身上获取。

在过去的研究中，人们发现原始卵泡和初级卵泡中的未成熟卵母细胞，相较于成熟卵母细胞，对低温损伤有着更强的抵抗力。这是因为它们细胞体积小、处于细胞周期前期、代谢速率较低、细胞内脂质较少，并且颗粒细胞数量也较少。近年来，OTC 研究取得了长足的进步，冷冻保存方法从传统的慢冻法逐渐发展到玻璃化冷冻法，冷冻保护剂（Cryoprotectant Agents，CPAs）的组合也日益丰富多样。玻璃化冷冻法因其操作简便、所需设备少的优势，逐渐成为研究的热门方向。多项研究成功实现了玻璃化冷冻小鼠窦前卵泡（原始卵泡和初级卵泡）的体外复苏，以及玻璃化冷冻绵羊卵巢自体原位移植后诞生小羊的案例。不过，目前 OTC 技术的效果仍存在提升空间，实验结果与新鲜组织对照组相比，仍有明显差距，这也为科研人员指明了后续的研究方向。

2. CPAs 的选择

玻璃化冷冻技术的关键在于高浓度的 CPAs，它们能够在样本浸入液氮后迅速形成玻璃态固体，就像给细胞穿上了一层 “防护铠甲”，有效保护细胞免受冰晶和高渗透压的伤害。然而，这层 “铠甲” 也并非完美无缺。在冷冻和解冻过程中，CPAs 会渗透进入细胞，导致细胞体积发生变化。细胞先是脱水收缩，随后随着 CPAs 的渗透又恢复原有大小和体积。这种体积的改变，如果速度过快或幅度过大，就可能对细胞造成损伤，甚至导致细胞死亡。因此，选择合适的 CPAs 及其浓度至关重要，这直接关系到能否将低温对细胞的损伤降至最低。

目前，CPAs 主要分为可渗透细胞膜的渗透剂和不可渗透细胞膜的非渗透剂两大类。渗透剂家族成员包括二甲基亚砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO）、乙二醇（Ethylene Glycol，EG）、1,2 - 丙二醇（1,2 - Propanediol，PROH）等，它们凭借着低分子量的优势，能够轻松穿透细胞膜；非渗透剂则有糖类（如蔗糖、海藻糖、棉子糖）、蛋白质、脂蛋白以及大分子物质（如费歇尔和聚乙烯吡咯烷酮）等，它们主要停留在细胞外溶液中，协助细胞脱水。

科研人员在探索合适的 CPAs 组合方面做了大量工作。研究发现，DMSO 和聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpyrrolidone，PVP）的组合在犬类 OTC 过程中，能够较好地维持卵泡形态，促进移植后初级和次级卵泡比例的增加，同时减少初级卵泡向次级卵泡转化阶段的异常。在猫卵巢组织冷冻实验中，向冷冻培养基中添加 40% 的 EG 和 0.1μM 或 0.5μM 的海藻糖，能够使冷冻后正常卵泡的比例接近新鲜组织。此外，在小鼠卵巢冷冻培养基中加入抗冻蛋白，有助于卵巢组织的保存和移植；添加褪黑素则能促进卵泡发育和雌激素受体表达，显著提升解冻后卵巢移植物的质量。这些研究成果充分表明，优化 CPAs 系统对于提高哺乳动物 OTC 效果具有重要意义。

3. OTC 的冷冻保存技术

• 慢冻法：慢冻法是目前较为常用的 OTC 方法之一。在操作过程中，首先将卵巢组织切成小薄片或碎片，放入含有低浓度 DMSO、蔗糖等的冷冻培养基中，接着将其置于摇床上进行短暂的冷冻平衡。随后，把样本转移到装有冷冻培养基的 4°C 冷冻瓶中，再通过可编程的机器设定逐步降温程序，最后将冷冻瓶放入液氮中保存，等待后续解冻使用。整个过程如同一场精确的 “低温之旅”，每一个步骤都需要严格控制，以确保卵巢组织在冷冻过程中尽可能减少损伤。
• 玻璃化冷冻法：玻璃化冷冻法是近年来发展起来的一项极具前景的细胞 / 组织冷冻保存技术。它的神奇之处在于，能够让液体或水溶液在不形成冰晶的情况下直接固化成玻璃态。为了实现这一效果，在将细胞或组织进行液氮深冻之前，需要使用高浓度的 CPAs 进行预处理。

研究表明，玻璃化冷冻法对颗粒细胞和卵巢基质细胞具有积极影响，在保存卵巢组织方面比慢冻法效果更佳，能够减少原始卵泡 DNA 链的断裂。同时，良好的基质细胞保存有助于提高移植后卵巢组织的功能。不过，对比慢冻法和玻璃化冷冻法，虽然两者在异种移植后都会使原始卵泡数量减少，但在卵泡存活和移植后生长方面，慢冻法仍略胜一筹。尽管如此，玻璃化冷冻法凭借其操作简便、成本效益高、对组织损伤小等优势，在卵母细胞和胚胎冷冻保存领域已被广泛接受，也为 OTC 技术提供了新的选择方向。

4. OTC 与卵母细胞冷冻保存的优劣对比

• OTC 的优势与局限：对于青春期前的癌症患者而言，在进行化疗或放疗之前，如果不适合进行卵巢刺激，OTC 和移植技术就成为了他们保存生育能力的希望之光。与单独冷冻卵母细胞或胚胎不同，卵巢组织中蕴含着大量的窦前卵泡，这些卵泡对冷冻损伤的抵抗力更强。因此，OTC 技术不仅能够同时保存众多窦前卵泡和雌性生殖干细胞，为恢复生育潜力奠定基础，还能维持卵巢的内分泌功能，让身体的激素水平保持相对稳定。

然而，OTC 技术也并非十全十美。建立 OTC 服务体系是一项复杂而艰巨的任务，需要专业的知识储备、当地或国家相关部门的审批，以及具备相应的存储设施。此外，OTC 和移植过程具有侵入性，需要进行两次手术，并且对手术技术要求较高，这不仅增加了患者的痛苦，也使得整个过程的成本大幅提高。

• 卵母细胞冷冻保存的特点：冷冻成熟的中期 II 卵母细胞、受精卵或胚胎是目前保护女性患者生育能力的常用方法。卵母细胞冷冻保存具有独特的优势，它不需要进行手术，并且已有经过充分验证的体外成熟（In Vitro Maturation，IVM）和体外受精（In Vitro Fertilization，IVF）方案可供使用。同时，这种方法还避免了胚胎创建过程中可能涉及的伦理和法律问题，成本相对较低。但它也存在一个明显的缺点，即与胚胎冷冻保存相比，卵母细胞的存活率较低。而且，胚胎和卵母细胞冷冻保存并不适用于那些需要紧急化疗、没有足够时间进行卵巢刺激的青春期前癌症患者。

5. OTC 在几种哺乳动物中的研究进展

• 小鼠：在 OTC 研究的动物模型中，小鼠凭借其繁殖周期短、易于操作等优势，成为了科研人员的得力助手。自首次成功利用甘油作为 CPAs 实现小鼠活产后，关于冷冻保存小鼠卵巢组织原位移植的研究不断涌现。科研人员深入探索了小鼠卵巢卵泡玻璃化冷冻的最佳条件，以及冷冻后卵泡中卵母细胞的发育潜力。研究发现，由 15% EG、15% DMSO 和 0.5μM 蔗糖组成的玻璃化冷冻液，在 HEPES 缓冲培养基 199 + 20% 血清替代物的环境下，能够有效保存卵巢组织。从玻璃化冷冻卵巢中获取的窦前卵泡，经过体外生长、IVM 和 IVF 后，其中的卵母细胞具备发育成幼崽的能力。研究人员将 72 个来自冷冻卵巢的 2 - 细胞胚胎移植到两只假孕小鼠体内，最终一只小鼠成功产下两只雄性幼崽。

为了降低高浓度 CPAs 的毒性，科研人员还尝试对小鼠窦前卵泡进行低浓度穿透性 CPAs（1.5μM）的玻璃化冷冻。实验结果显示，虽然冷冻后成熟卵母细胞的数量明显少于新鲜对照组，但约一半来自冷冻窦前卵泡的胚胎能够发育成囊胚。将这些囊胚移植后，成功诞生了健康的后代。这些研究充分证明了利用体外培养系统从冷冻保存的卵巢组织中获得可存活后代的可行性。

• 人类：2004 年，人类 OTC 和原位自体移植迎来了历史性的突破，首例活产成功诞生。次年，又有解冻冷冻卵巢皮质组织移植后活产的案例报道。2015 年，更是传来令人振奋的消息，首次实现了月经初潮前提取的卵巢组织自体移植后活产，这意味着青春期前的卵巢组织也能够成功冷冻、解冻并孕育生命。截至目前，已有超过 130 例冷冻卵巢组织移植后活产的报道，并且几乎所有患者在组织植入后都恢复了卵巢功能。在青春期后的女性中，卵巢自体移植成功恢复了生育能力，报道的妊娠率在 23% - 37% 之间。

随着研究的不断深入，生育力保存领域也取得了新的进展，如利用细胞外组织基质支架进行人工卵巢移植，以及使用鞘氨醇 - 1 - 磷酸、肝素结合肽修饰的纤维蛋白、肝素和血管内皮生长因子等。然而，原位自体移植也面临着一些挑战，患者移植预处理后的组织需要克服移植过程中的缺血损伤，同时还要警惕癌细胞重新植入的风险。目前，这些问题对后代的潜在影响尚不明确，移植成功率也有待进一步提高。总体而言，OTC 和自体移植目前仍处于探索阶段，但未来的研究有望为面临卵巢损伤和不孕风险的女性带来更多希望。

• 牛：在畜牧业中，牛作为一种重要的大型动物模型，为 OTC 研究提供了宝贵的实验样本。早期研究发现，玻璃化冷冻和慢冻法都会使奶牛卵巢中的卵泡数量减少，但在组织学评估方面，两者并无显著差异。冷冻后的卵巢组织碎片在培养基中仍能展现出正常的发育能力。在牛和人类样本中，新鲜和玻璃化冷冻卵巢皮质组织中卵母细胞的存活率均超过 89%，并且成功对 6 头奶牛进行了卵巢组织自体移植，移植后卵母细胞依然保持活力。

科研人员还对冷冻胎牛卵巢中原始卵泡的存在和激活情况进行了研究，发现玻璃化冷冻能够减少原始卵泡的形态损伤，维持其激活能力。此外，在冷冻牛卵巢组织的恢复过程中，使用甲胎蛋白进行处理，能够显著提高异种移植后卵巢组织的质量。甲胎蛋白可以有效防止卵巢组织损伤，维持其形态，减少玻璃化冷冻过程中牛卵巢组织及其移植物中卵泡的凋亡。由于牛和人类卵巢具有一定的相似性，这些研究成果为包括人类在内的其他物种卵巢皮质组织的低温保存奠定了坚实的基础。

• 猪：猪的卵巢组织含有不同发育阶段的卵泡，这些卵泡可用于卵母细胞的培养和获取，对于家畜和濒危动物的遗传资源保护具有重要意义。研究发现，新生猪的原始卵泡在玻璃化冷冻和解冻后，仍能保持发育能力，尽管其发育速度比新鲜对照组稍慢。科研人员对人类、牛和猪的卵巢组织平衡冷却和玻璃化冷冻的效率进行了比较，发现 DMSO 和 PROH 对人类和牛的卵巢组织会造成显著的结构损伤，但却能在不损伤次级卵泡的情况下保存猪的原始卵泡，这表明玻璃化冷冻法在猪卵巢组织保存方面更为有效。

然而，高浓度蔗糖在玻璃化冷冻培养基中对猪卵巢组织中窦前卵泡的保存具有不利影响。目前，人类和牛的卵巢组织玻璃化冷冻已取得较高的存活率，但猪的卵巢组织冷冻存活率仍处于较低水平。未来，优化猪 OTC 的冷冻条件和程序，成为了保护猪遗传资源的关键任务。

• 绵羊和山羊：对绵羊和山羊卵巢组织冷冻保存的研究已有数十年的历史。研究发现，绵羊卵巢在 - 196°C 冷冻三个月后自体移植，卵泡数量虽显著减少，但剩余卵泡仍保留发育能力。适当浓度的 CPAs 对绵羊和山羊原始卵泡的形态、基质细胞密度以及卵泡发育有着重要影响，这充分证明了玻璃化冷冻卵巢方法在绵羊和山羊中的可行性。

进一步研究发现，α - 硫辛酸（Alpha Lipoic Acid，ALA）能够减少玻璃化冷冻绵羊卵巢组织的卵泡退化、衰老、纤维化以及高水平自由基的产生。在绵羊卵巢组织玻璃化冷冻前，使用白血病抑制因子（Leukemia Inhibitory Factor，LIF）进行预处理，可以降低冷冻损伤，促进卵巢卵泡的生长和发育，维持其功能。此外，含有 0.25μM 蔗糖和 10% 胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）的冷冻培养基能够有效地对山羊卵巢组织进行玻璃化冷冻。通过比较绵羊全卵巢慢冻法和玻璃化冷冻法对生育力保存的效果，发现全卵巢玻璃化冷冻在卵泡存活方面表现更优，这也凸显了维持细胞内环境稳定对于 OTC 的重要性。这些研究成果为绵羊和山羊的种质资源保护提供了有力支持。

• 猫：对猫进行辅助生殖技术研究主要有两个重要原因。一方面，大多数猫科动物在其原生栖息地面临着生存威胁，甚至濒临灭绝；另一方面，家猫可以作为辅助生殖技术研究的模型。对冷冻保存猫卵巢组织自体移植的研究发现，移植后卵泡数量减少，纤维化程度增加，但剩余卵泡仍能恢复发育，直至发育到窦卵泡阶段。科研人员对猫卵巢的冷冻保存方案进行评估后发现，尽管卵泡存活率较低，但卵泡仍能够发育到窦卵泡阶段，这表明猫卵巢的冷冻保存是可行的。

值得一提的是，促红细胞生成素（Erythropoietin，EPO）在猫卵巢组织异种移植后的血管再生成过程中发挥了积极作用。它能够有效提高冷冻保存猫卵巢组织的卵泡存活率、维持卵泡活力，并促进组织血管再生成。这些研究成果为保护野生猫科动物提供了新的技术手段和理论依据。

• 狗：与其他动物相比，犬类卵巢组织冷冻保存技术的报道相对较晚。研究发现，在保存犬类卵巢组织的可行卵泡方面，慢冻法比玻璃化冷冻法更具优势，因此成为了目前犬类 OTC 的首选技术。科研人员对两种不同的 CPAs（DMSO 和 PROH）在犬卵巢皮质慢冻法中的效果进行了测试，发现含有 DMSO 的冷冻培养基能够使犬卵母细胞获得更高的存活率。

此外，EPO 在犬类 OTC 中的作用也逐渐受到关注，研究表明脱唾液酸 EPO 可能对犬卵巢组织异种移植后的卵泡存活具有积极影响。随着全球宠物狗数量的不断增加，对于珍贵犬种、情感宠物犬以及优秀军警犬遗传物质的保存变得愈发重要。基于其他物种的研究进展，未来迫切需要进一步改进犬类 OTC 的相关技术。

6. 结论与展望

玻璃化冷冻法和慢冻法是哺乳动物 OTC 的两种主要方法。玻璃化冷冻法通常使用更高浓度的 CPAs，在实际操作中比慢冻法更为便捷。慢冻法需要配备具有编程程序的自动化低温存储设备，整个过程大约需要 3 - 4 小时；而玻璃化冷冻法仅需几分钟即可完成，且无需特殊设备。玻璃化冷冻法的出现，为包括人类在内的多种物种卵巢组织、卵母细胞和胚胎的冷冻保存带来了革命性的变化。

尽管哺乳动物 OTC 已取得了一定的进展，但仍面临诸多挑战。首先，无论是玻璃化冷冻还是慢冻法，都会对卵巢组织造成一定损伤，导致部分窦前卵泡丢失。其次，玻璃化冷冻卵巢组织的移植率低于慢冻法。再者，CPAs 的类型和浓度、冷冻时间、温度、卵巢组织厚度以及冷冻设备的改进等多方面因素，都需要进行综合平衡，才能实现更有效的 OTC。此外，冷冻卵巢组织体积较小，给移植操作带来了困难；而且冷冻卵巢组织没有血液循环，移植后缺血再灌注损伤可能会缩短组织的存活时间。

目前，灵长类动物、人类、绵羊和小鼠在冷冻卵巢组织移植后均有活产报道，而其他哺乳动物移植后仅有卵泡发育的相关报道。随着技术的不断发展，OTC 技术有望比卵母细胞和胚胎冷冻保存更具意义。因为它不仅能够保存大量的窦前卵泡和雌性生殖干细胞，还能将冷冻的卵巢组织移植回体内，使受体动物在未来有机会实现自然受孕，更好地保护其宝贵的生育能力。相信在科研人员的不懈努力下，OTC 技术将不断完善，为生命科学和医学领域带来更多的惊喜与突破。