犬干扰素刺激反应元件（ISREs）的鉴定及 CaIFNα活性检测新方法的建立

为明确犬 ISREs 作用并检测 IFN 活性，研究人员鉴定犬 ISREs，开发新检测方法，助力相关研究。

　　在动物的免疫系统中，干扰素（IFN）就像是一群英勇的 “卫士”，时刻守护着机体免受病毒的侵害。IFN 能激活一系列免疫机制，抑制病毒的复制，在免疫反应中发挥着至关重要的作用。其中，I 型 IFN，像由成纤维细胞和单核细胞产生的 IFN^α/β，更是抗病毒的主力军，它们能增强机体免疫，促进记忆反应的产生。犬干扰素 α（CaIFN^α）作为 I 型 IFN 的一种，同样在犬类对抗病毒感染的过程中有着重要意义，它具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种功能，在临床治疗中也展现出了一定的潜力，比如对上皮淋巴瘤患犬的治疗。

然而，目前对于犬 IFN 的研究还存在不少问题。在检测 IFN 活性方面，传统方法如细胞病变抑制试验和荧光素酶报告基因试验都有各自的缺陷。细胞病变抑制试验耗时久、依赖病毒复制，还对实验环境要求高；荧光素酶报告基因试验则是一种间接方法，易受多种因素影响。而对于犬干扰素刺激反应元件（ISREs）的研究更是相对有限，缺乏可靠的基于 ISREs 检测 CaIFN^α活性的方法。这些问题严重阻碍了对 CaIFN^α功能的深入了解和临床应用的拓展。

为了解决这些难题，来自华南农业大学兽医学院等多个研究机构的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《BMC Veterinary Research》杂志上，为犬类抗病毒研究领域带来了新的曙光。

研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：一是利用毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统表达和纯化 CaIFN^α；二是通过生物信息分析预测犬 ISREs，并构建 ISRE 报告质粒；三是运用病毒抑制试验，使用水疱性口炎病毒（VSV）、犬流感病毒（CIV）和 H9N2 病毒评估重组 CaIFN^α的抗病毒活性；四是采用间接免疫荧光测定（IFA）和基于 ISRE 及增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的流式细胞术检测 CaIFN^α活性。

研究结果如下：

1. CaIFN^α的表达与纯化：研究人员构建了原核和酵母表达载体来表达 CaIFN^α。结果发现，在大肠杆菌中表达时，目标蛋白主要以包涵体形式存在，可溶性蛋白少；而在毕赤酵母表达系统中，目标蛋白成功表达，且浓度较高，表明毕赤酵母更适合表达 CaIFN^α。
2. CaIFN^α的抗病毒活性：通过病毒抑制试验，研究人员发现经 CaIFN^α处理的细胞在感染 VSV 和 CIV 后，能有效抵抗病毒攻击，减少细胞病变。计算得出 CaIFN^α对 VSV 和 CIV 的抗病毒活性分别为 2.96×10⁴ U/mg 和 6.03×10³ U/mg。同时，IFA 检测显示，CaIFN^α能抑制 H9N2 流感病毒在 MDCK 细胞中的增殖，且在不同稀释度下都有抗病毒效果。这一系列实验证实了 CaIFN^α具有多种抗病毒活性。
3. 犬 ISREs 的筛选与鉴定：研究人员经生物信息分析、筛选和克隆候选 ISRE 序列，通过荧光检测发现 CaIFN^α能激活 ISRE2、ISRE8 和 ISRE10，促进 EGFP 表达，表明这三个序列是有效的犬 ISREs，可用于精确评估 CaIFN^α的活性。
4. 基于 ISRE 的 CaIFN^α活性定量分析：利用流式细胞术对 CaIFN^α激活 ISRE 序列进行定量分析，结果显示 ISRE8 转染细胞在 CaIFN^α刺激后荧光细胞数量增加最多。进一步实验表明，即使在低浓度 CaIFN^α下，该方法仍能检测到其激活活性，验证了该方法的高灵敏度。

研究结论和讨论部分指出，研究人员成功在毕赤酵母中实现了 CaIFN^α的分泌表达，纯化后的蛋白对 VSV、CIV 和 H9 流感病毒都有抗病毒活性。同时，鉴定出了犬 ISREs 成分，并开发了基于 ISRE 的流式细胞术检测 CaIFN^α生物活性的新方法。这一成果为 CaIFN^α的活性定量和进一步研究奠定了基础，有助于深入了解犬的抗病毒免疫机制，推动 CaIFN^α在临床治疗犬类病毒感染性疾病中的应用。不过，该研究也存在一定的局限性，如检测方法对设备和操作人员要求较高，不同实验室间数据可比性差，且未对更多常见犬病毒进行评估。未来的研究可以朝着优化检测方法、扩大病毒检测范围等方向展开，进一步完善对 CaIFN^α的研究和应用。