新型共价化学探针：抗击基孔肯雅病毒及其他甲病毒的有力武器

研究人员针对基孔肯雅病毒无特效药物问题，研究新型化学探针，发现 SGC-NSP2PRO-1 有抗甲病毒活性且具高选择性。

　　基孔肯雅病毒（Chikungunya virus，CHIKV）是一种通过蚊子传播的病毒，它会引发高烧和严重的关节疼痛，给患者带来极大的痛苦。不仅如此，像东部马脑炎病毒（EEEV）、委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）和马亚罗病毒（MAYV）等甲病毒属的其他病毒，也在全球范围内对人类健康构成严重威胁。目前，针对这些病毒，尚无获批的特效抗病毒药物，这无疑是摆在医学领域面前的一道难题。为了攻克这一难关，来自美国北卡罗来纳大学教堂山分校、多伦多大学等多个机构的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Scientific Reports》上，为抗击这些病毒带来了新的希望。

在这项研究中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先是化学合成技术，他们成功合成了新型化合物 SGC-NSP2PRO-1（3）及其阴性对照类似物 SGC-NSP2PRO-1N（4），还制备了用于化学蛋白质组学研究的相关类似物。其次，利用酶抑制实验，研究化合物对 nsP2 半胱氨酸蛋白酶（nsP2pro）的抑制活性。同时，借助化学蛋白质组学技术，包括 TAMRA 标记和生物素下拉实验，评估化合物在蛋白质组范围内的选择性。此外，通过细胞活性实验，检测化合物对病毒复制的抑制作用以及细胞毒性。

下面来看具体的研究结果：

1. 化学探针特性
   • 化学性质：通过对 5 - 元杂环核心进行结构 - 活性研究，发现将氮换成氧得到的异恶唑 SGC-NSP2PRO-1（3），不仅不会发生分子内环化，而且在室温下储存 6 个月以及在 pH 3 - 12 的溶液中都十分稳定。其水动力学溶解度为 20 μM，远高于抑制 nsP2pro 的 IC₅₀值，且未出现聚集现象。在 5 mM 谷胱甘肽（GSH）存在下，其乙烯砜的半衰期为 70 min，满足共价抑制剂的要求。
   • 生物学活性：SGC-NSP2PRO-1（3）对 CHIKV nsP2 蛋白酶具有强效的共价抑制作用，IC₅₀为 40 nM，其 kinact / Ki 比值达到 5950 M^-1 s^-1，表明它是一种高效的非肽共价半胱氨酸蛋白酶抑制剂。在抑制甲病毒复制方面，对 CHIKV - nLuc 和 VEEV - nLuc 报告病毒的 EC₅₀分别为 0.05 μM 和 0.5 μM。对 CHIKV、MAYV 和 VEEV 的感染性分离株，能使病毒滴度呈剂量依赖性下降 5 - 9 log，对 EEEV - nLuc 复制子也有活性，且在人细胞（A549ACE2 和 HEK293）中，浓度高达 10 μM 时无细胞毒性。
   • 靶点结合：通过质谱分析表明，SGC-NSP2PRO-1（3）能够与 CHIKV nsP2pro 活性位点的催化半胱氨酸 C478 结合，且只对该位点进行修饰，对其他 5 个半胱氨酸残基无修饰，证明了其特异性。
   
   
2. 半胱氨酸蛋白酶选择性
   • 针对多种半胱氨酸蛋白酶的筛选：SGC-NSP2PRO-1（3）在 10 μM 浓度下，对 20 种人类半胱氨酸蛋白酶和 3 种病毒半胱氨酸蛋白酶进行筛选，结果显示它对组织蛋白酶、泛素特异性肽酶（USPs）等多种蛋白酶均无显著抑制作用，对 CHIKV nsP2pro 的选择性比其他半胱氨酸蛋白酶高 30 倍以上。
   • 蛋白质组范围的选择性评估：在 HEK293 细胞中，通过 TAMRA 标记和生物素 - 链霉亲和素下拉这两种独立的化学蛋白质组学实验评估 SGC-NSP2PRO-1（3）的蛋白质组范围选择性。TAMRA 标记实验中，合成的可点击异恶唑 VS 和相应荧光探针 TVS 实验表明，VS 对 CHIKV nsP2pro 有抑制作用，且在 HEK293 细胞裂解物中，VS 只标记 nsP2，不标记其他人类蛋白。生物素 - 链霉亲和素下拉实验进一步证实，SGC-NSP2PRO-1（3）在蛋白质组范围内具有高选择性，几乎没有发现脱靶蛋白。
   
   
3. 阴性对照类似物：研究人员发现 MOM - 1 作为之前的阴性对照存在缺陷，进而筛选出 SGC-NSP2PRO1N（4）作为新型阴性对照类似物。它保留了乙烯砜共价弹头，但对 CHIKV nsP2pro 的抑制作用比 SGC-NSP2PRO-1（3）弱 100 倍以上，在 CHIKV - nLuc 复制实验中，浓度高达 10 μM 时也无活性，且在储存和溶液中稳定性良好。

研究结论和讨论部分指出，SGC-NSP2PRO-1（3）作为一种高质量的共价化学探针，满足了共价化学探针的所有要求，包括快速的酶失活动力学、蛋白质组范围的选择性以及强大的细胞活性且无毒性。它具有泛抗甲病毒活性，是研究 nsP2pro 在甲病毒复制、传播和毒力方面作用的有力工具。而 SGC-NSP2PRO-1N（4）作为阴性对照类似物，为相关研究提供了重要的对比参考。此外，该研究还发现内部乙烯砜作为共价弹头具有高蛋白质组范围的选择性，值得进一步研究，有望开发出更多的共价半胱氨酸蛋白酶抑制剂和候选药物分子。不过，SGC-NSP2PRO-1（3）在小鼠体内的药代动力学性质较差，限制了其在体内研究的应用，目前更适用于体外和细胞研究，但这并不影响其在研究甲病毒方面的重要价值。