梨自交不亲和位点的序列特征：长读长测序带来的新发现

为探究梨自交不亲和位点（S - 位点）相关问题，研究人员对梨基因组测序，发现 17 - 21 个 SFBBs，为相关研究提供依据。

　　在植物的繁衍过程中，自交不亲和（Self - incompatibility，SI）是一种奇妙且重要的遗传机制。大约 40% 的开花植物都拥有这种机制，它能有效防止近亲繁殖，保证物种的遗传多样性。想象一下，如果植物总是自花授粉，就像人类近亲结婚一样，后代可能会携带各种遗传问题，难以在复杂多变的环境中生存。

自交不亲和主要分为两种类型，其中配子体自交不亲和（gametophytic SI，GSI）广泛存在于蔷薇科、茄科和车前草科等植物中。在这些植物里，GSI 由 S 位点控制，S 位点包含在雌蕊中表达的 S - RNase 基因和在花粉中表达的多个 S 位点 F - box（SLF/SFB）蛋白基因。当花粉进入雌蕊后，如果花粉的 S 单倍型与花柱中的任何一个 S 单倍型相同，S - RNase 就会阻碍花粉管的生长，从而阻止自花授粉。

然而，在梨属（Pyrus）植物中，关于 S 位点 F - box 兄弟基因（SFBBs）与非自我 S - RNase 相互作用的具体情况还存在许多未知。比如，到底有多少个 SFBBs 能与非自我 S - RNase 发生相互作用，以及它们在自交不亲和过程中究竟扮演着怎样的角色，这些问题一直困扰着科研人员。为了解开这些谜团，南京农业大学的研究人员展开了深入研究，相关成果发表在《Molecular Horticulture》上。

研究人员采用了多种关键技术方法。首先是 PacBio 长读长测序技术，利用该技术成功组装了梨品种‘Yali’（Pyrus bretschneideri）的基因组。同时，结合 Illumina 短读长测序技术对组装结果进行优化。此外，运用酵母双杂交（Yeast - two - hybrid，Y2H）和萤火虫荧光素酶互补成像（Firefly luciferase complementation imaging，FLCI）等实验技术，来探究 SFBBs 与自我 / 非自我 S - RNases 之间的相互作用。

研究结果如下：

• ‘Yali’基因组组装及 S₁₇位点鉴定：通过 PacBio 长读长测序和 Illumina 短读长测序技术相结合，研究人员成功组装了‘Yali’的基因组。该基因组大小为 534.45Mb，包含 582 个重叠群，N50 为 1.81Mb。经评估，组装的完整性达到 95.2%，表明组装结果可靠。在组装的基因组中，研究人员成功鉴定出 S₁₇ - RNase 位于 contig 33 上。
• S₁₇位点 F - box 基因的鉴定：以 Pyrus 和 Malus 的 SFBBs 保守 F - box 基序为查询序列，在‘Yali’基因组的 contig 33 中进行搜索，共鉴定出 19 个 SFBBs。这些 SFBBs 分布在 S₁₇ - RNase 上游 0.94Mb 到下游 0.83Mb 的区域内。进一步在其他 Pyrus 和 Malus 的 S 位点进行搜索，发现 Pyrus 和 Malus 的 S 位点包含 17 - 21 个 SFBBs，而 Prunus 的 S 位点所含的 SLFs/SFBs 数量相对较少。
• 蛋白质编码 SFBBs 的序列分析：对来自 Pyrus 和 Malus 的 177 个 SFBBs 进行系统发育分析，结果显示这些 SFBBs 可分为 22 个不同的组。同一组内的 SFBBs 在核苷酸和氨基酸水平上具有较高的序列同一性，而不同组之间的序列同一性较低。通过分析还发现，Pyrus 和 Malus 的 S 位点存在多种基因复制事件，如分散复制、近端复制、串联复制和转座复制等，同时也频繁发生基因的缺失、倒位和易位等现象。
• SFBBs 非编码侧翼序列的比较分析：研究人员对 SFBBs 的非编码侧翼序列进行分析，发现其序列多态性较高。在不同 S 位点的 SFBBs 之间，其上游和下游序列的同一性较低；而在同一组内的 SFBBs 之间，其编码序列的同一性较高。此外，还发现长末端重复（LTR）反转录转座子在 S 位点中广泛存在，且在某些区域的密度较高，这可能与 SFBBs 的基因变异有关。
• Pyrus S₁₇位点 SFBBs 的遗传和组织特异性表达：通过对‘Yali’和‘Xueqing’杂交后代的分析，发现 Pyrus S₁₇位点的 19 个 SFBBs 与 S₁₇ - RNase 共分离。转录组数据分析表明，18 个 SFBBs 在花粉中特异性表达，而 S₁₇ - RNase 在花柱中特异性表达。这表明这 18 个花粉特异性表达的 SFBBs 可能是花粉 S 决定因子的候选基因。
• S - RNases 与 SFBBs 的物理相互作用：利用 Y2H 和 FLCI 实验技术，研究人员发现 Pyrus S₁₇位点的 18 个花粉特异性表达的 SFBBs 中，有 8 个能与至少一种非自我 S - RNase 相互作用，而其余 10 个未检测到与测试的 S - RNases 有相互作用。进一步研究发现，S - RNase 的高变（HV）区域在与 SFBBs 的相互作用中起着关键作用。亚细胞定位实验表明，这 8 个与非自我 S - RNases 相互作用的 SFBBs 定位于细胞质中。
• Pyrus S₁₇位点的其他基因：在‘Yali’基因组的 S₁₇位点，除了 S - RNase 和 SFBBs 外，还发现了 114 个基因。在其他 Pyrus 和 Malus 的 S 位点也存在数量不等的基因，其中有 29 个基因在所有测试的 S 位点中都存在。转录组数据分析发现，部分基因在花柱中表达，可能与花柱的生长和发育有关；部分基因在花粉和花柱中都表达，可能参与花粉管的生长和自交不亲和反应。

研究结论和讨论部分指出，通过长读长测序技术，研究人员揭示了 Pyrus 和 Malus 的 S 位点包含 17 - 21 个 SFBBs，这些 SFBBs 分布在 1.35 - 2.64Mb 的区域内，可分为 22 个组。18 个花粉特异性表达的 SFBBs 是花粉 S 决定因子的良好候选基因，其中 8 个能与至少一种非自我 S - RNase 相互作用，这为梨属植物中基于 S - RNase 的 GSI 存在协同非自我识别系统提供了有力证据。此外，研究还发现 LTR 反转录转座子与 SFBBs 的基因变异和重排密切相关。

这项研究为深入理解梨属植物的自交不亲和机制提供了重要依据，有助于进一步揭示植物生殖生物学的奥秘，也为果树的遗传育种提供了理论基础，具有重要的科学意义和应用价值。