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为探究帕金森病相关激酶 PINK1 的作用机制，研究人员用 TAK-243 处理细胞，发现 PINK1 积累与翻译有关且有 “记忆” 现象，为相关研究提供新思路。
帕金森病，这个名字或许大家并不陌生，它就像一个隐藏在身体里的 “捣乱分子”，悄无声息地影响着无数人的生活。患者常常会出现手抖、行动迟缓等症状，严重影响生活质量。而帕金森病的发生，和一种名为 PINK1（帕金森病相关激酶 1）的蛋白有着千丝万缕的联系。
一直以来，科学家们对 PINK1 蛋白充满了好奇。正常情况下，PINK1 是个 “短命鬼”，刚进入线粒体就被 “切割”，然后被蛋白酶体降解。但当线粒体出现问题，膜电位消失时，它却像被激活的 “战士”，迅速在受损线粒体上积累并变得活跃起来，给泛素（ubiquitin）和泛素 E3 连接酶 Parkin 的 Ser65位点加上磷酸基团，进而启动细胞的 “自噬程序”（mitophagy），清理受损的线粒体。可这里面还有许多谜团没解开，比如在视网膜色素上皮细胞中，线粒体膜电位消失后，PINK1 到底是怎么积累的？它的积累仅仅是因为不再被降解，还是有其他原因？
为了搞清楚这些问题，来自国外的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《SCIENCE ADVANCES》上，为我们理解 PINK1 蛋白的作用机制带来了新曙光。
研究人员在实验过程中，运用了多种关键技术方法。细胞模型构建技术，通过 CRISPR-Cas9 技术构建 PINK1 基因敲除（KO）细胞系，并在此基础上建立可诱导表达 PINK1-Flag 的细胞系；蛋白质分析技术，采用蛋白质免疫印迹（Western blotting）检测蛋白质表达和磷酸化水平，运用亚细胞分级分离技术研究蛋白质在细胞内的分布；基因表达分析技术，利用定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测 PINK1 mRNA 水平；线粒体膜电位检测技术，借助特定染料染色和显微镜成像测定线粒体膜电位变化 。
下面来看看具体的研究结果：
- TAK-243 重定向 PINK1 活性：研究人员选用缺乏可检测 Parkin 但有 PINK1 底物的 RPE1 细胞，用 TAK-243 抑制泛素 E1 酶 UBA1。实验发现，TAK-243 处理后，细胞内泛素化水平下降，PINK1 会将活性转向游离的泛素分子，使游离的磷酸化泛素（pUb）增多，且主要存在于细胞质中。
- TAK-243 稳定 cPINK1：研究人员对比 TAK-243、蛋白酶体抑制剂环氧霉素（epoxomicin）等对细胞的影响，发现 TAK-243 能像蛋白酶体抑制剂一样，使细胞出现切割后的 PINK1（cPINK1）。进一步研究发现，cPINK1 的产生需要线粒体参与，而且在有呼吸链抑制剂抗霉素 A（antimycin A）和寡霉素 A（oligomycin A）（AO）使线粒体去极化时，cPINK1 依然会产生，同时还会积累全长 PINK1。对 cPINK1 的激活状态检测发现，虽然其积累量与 AO 处理无关，但 AO 能增强它的激活。
- PINK1 稳定性测量：研究人员用环己酰亚胺（cycloheximide）追踪实验，对比未处理细胞和 AO 处理 4 小时细胞中全长 PINK1 的半衰期。结果显示，未处理细胞中 PINK1 半衰期约 30 分钟，AO 处理 4 小时后，PINK1 水平增加约 3.5 倍，但只有约 25% 是稳定的，其余快速降解，和未处理细胞类似，且此时 PINK1 mRNA 水平不变，这表明 PINK1 在去极化条件下积累可能与翻译增加有关。
- AO 预处理对 PINK1 活性的影响：研究人员先对细胞进行 4 小时 AO 处理，然后洗掉药物使线粒体膜电位恢复。在洗药时加入 TAK-243，发现处理的样本中出现第二波游离 pUb 生成，且与 cPINK1 的出现同步。延长恢复时间到 16 小时再用 TAK-243 处理，发现之前的 AO 处理能让新产生的 cPINK1 激活并磷酸化游离泛素，这说明 PINK1 在去极化处理后能保留活性，像有 “记忆” 一样。
在研究结论和讨论部分，研究人员发现，TAK-243 为研究 PINK1 提供了新方法，它能产生 cPINK1，且不影响线粒体对 PINK1 的切割。研究还表明，去极化后全长 PINK1 积累，可能是因为存在两种合成途径，一种对电压不敏感，会导致降解，另一种敏感，能产生稳定的全长 PINK1，而且 PINK1 翻译可能在去极化条件下增加。此外，cPINK1 中存在激活状态的分子，它除了参与线粒体自噬，可能还有其他生理作用。研究人员还发现了与 PINK1 活性相关的 “预处理” 现象，这可能和一些线粒体连续受损的病理情况有关，意味着一个小小的 PINK1 蛋白，可能藏着治疗相关疾病的大秘密，为后续帕金森病等相关疾病的研究提供了新方向和潜在靶点，有望推动相关治疗手段的开发，给患者带来新的希望。
