结构解析揭示剪接体保真度的分子机制：DHX35–GPATCH1 介导对异常剪接底物的识别与处理

为探究剪接体识别和排除次优剪接底物的机制，研究人员解析嗜热真核生物剪接体质控复合物结构，揭示关键蛋白作用。

　　在细胞的 “加工厂” 里，有一种叫做剪接体（spliceosome）的神秘 “机器”，它负责对前体信使核糖核酸（pre-mRNA）进行精准 “剪裁”，将其中的内含子（intron）去除，把外显子（exon）连接在一起，生产出成熟可用的信使核糖核酸（mRNA），这个过程就叫做 RNA 剪接。然而，在这个复杂的 “剪裁” 过程中，剪接体如何精准识别并剔除那些 “不合格” 的次优剪接底物，一直是个未解之谜。为了揭开这个谜团，来自复旦大学等机构的研究人员开展了深入研究，相关成果发表在《Cell Research》上。

此前的研究虽然对剪接体的组装、催化和拆卸过程有了一定了解，但对于其识别异常剪接底物的分子细节却知之甚少。RNA 解旋酶在剪接过程中参与质量控制，可确保只有正确剪接的 mRNA 才能被输出细胞核，但不同解旋酶在这一过程中的具体作用及协同机制尚不明确。在这种背景下，探究剪接体识别和处理异常底物的机制显得尤为重要。

为了深入研究这一问题，研究人员选择了嗜热丝状真菌嗜热毛壳菌（Chaetomium thermophilum）作为研究对象。嗜热毛壳菌生长的适宜温度为 50°C，能在高达 60°C 的环境中繁殖，此前已有多种保守的大分子核糖核蛋白（RNP）复合物成功从该菌中分离，适合进行生化和结构分析。研究人员以保守的拆卸因子 DHX15 为诱饵，对嗜热毛壳菌的剪接体进行了分离和纯化，利用冷冻电镜（cryo-EM）技术解析了剪接体的结构，并通过 RNA 测序等方法研究了剪接体对异常底物的识别和处理机制。

研究结果如下：

1. 剪接体的分离与鉴定：研究人员通过对嗜热毛壳菌进行基因工程改造，以 DHX15 为诱饵进行串联亲和纯化，成功分离出了多种剪接体复合物。冷冻电镜分析显示，这些复合物包括内含子套索剪接体（ILS）以及两种异常剪接体组装状态（B*^Q1和 B*^Q2），它们代表了在向 B * 转变过程中被质量控制拦截的 B^act复合物12。
2. ctILS 复合物的结构解析：研究人员解析了 ctILS 复合物的结构，分辨率达到 2.8 ?。该结构显示，ctILS 复合物与秀丽隐杆线虫的 ceILS 复合物高度相似，这表明剪接体结构在不同物种间具有高度的保守性。此外，研究人员还在 ctILS 复合物中明确了 DHX15 - TFIP11 - GCFC2 复合物的位置，该复合物负责在后续步骤中拆卸 ILS 复合物34。
3. DHX35 - GPATCH1 对异常 B * 剪接体的质量控制：在 B*^Q1和 B*^Q2复合物中，研究人员发现了 RNA 解旋酶 DHX35 和 G - 补丁蛋白 GPATCH1。通过对预 mRNA 5’剪接位点（5’ss）区域构象的分析，研究人员发现，由于 5’ss 凸起，U2 / 分支位点（BS）螺旋的重定位受阻，从而阻碍了剪接反应的进一步进行。RNA 测序分析表明，敲低 DHX35 和 GPATCH1 会导致含有低效 5’ss 基序的 pre - mRNA 的剪接事件增加，这表明 DHX35 - GPATCH1 在识别和处理异常 5’ss 底物中发挥着重要作用56。
4. DHX15 - TFIP11 对异常 B * 剪接体的质量控制：研究人员在 B*^Q复合物中发现了拆卸因子 TFIP11、GCFC2 和 DHX15。TFIP11 - GCFC2 复合物与 SKIP 和 PRP8 结合，阻止了 RNA 解旋酶 DHX16、DHX38 和 DHX8 的招募，从而阻碍了剪接反应的进行。这表明 DHX15 - TFIP11 - GCFC2 复合物在识别和拆卸含有异常 pre - mRNA 的剪接体中发挥着重要作用78。
5. GPATCH1 识别异常 5’ss 凸起环：GPATCH1 通过与 PRP8 和 DHX35 的多个区域相互作用，将 DHX35 锚定到剪接体上，并探测活性中心的 pre - mRNA。GPATCH1 的结合阻止了 U2/BS 螺旋的移动，同时通过其芳香族氨基酸 W66 探测和稳定 5’ss 凸起的构象，从而防止剪接反应的进一步进行910。
6. DHX35 解开 U2/BS 螺旋，促使剪接体准备拆卸：在 B*^Q复合物中，DHX35 与 U2 snRNA 的单链 BS 区域结合，解开了 U2/BS 螺旋。这一过程由 GPATCH1 辅助，GPATCH1 与 U2 snRNA 形成两个关键的堆积相互作用，引导 U2 snRNA 进入 DHX35 的 RNA 结合通道。DHX15 在 B*^Q2复合物中的位置与在 ctILS 复合物中相似，靠近 U6 snRNA，可能准备对剪接体进行拆卸1112。

研究结论和讨论部分指出，该研究揭示了两个 RNA 解旋酶复合物 DHX35 - GPATCH1 和 DHX15 - TFIP11 在识别和拆卸异常剪接体中的关键作用。它们通过协同作用，将 5’ss 校对与剪接体拆卸联系起来，确保了剪接的保真度。此外，研究还发现，异常 5’ss 凸起可能是一个更普遍的剪接准确性问题，GPATCH1 - DHX35 在不同物种中可能发挥相似的校对作用。然而，研究也存在一些局限性，例如 B*^Q复合物可能被靶向降解异常剪接底物，也可能通过重排或新一轮组装产生有成效的剪接反应，这需要进一步的研究来证实。未来的研究可以通过对 B*^Q剪接体相关转录本的 RNA 测序，深入了解 B*^Q复合物的生物学作用。

研究人员在这项研究中主要运用了以下关键技术方法：一是冷冻电镜技术，用于解析剪接体复合物的高分辨率结构；二是 RNA 测序技术，通过对敲低 DHX35 和 GPATCH1 后的细胞进行 RNA 测序，分析剪接事件的变化；三是蛋白质纯化技术，利用串联亲和纯化方法从嗜热毛壳菌中纯化剪接体复合物。通过这些技术的综合运用，研究人员成功揭示了剪接体识别和处理异常底物的分子机制。

总的来说，这项研究为理解剪接体的质量控制机制提供了重要的结构和功能见解，对于深入了解 RNA 剪接过程以及相关疾病的发生机制具有重要意义。