缺氧诱导的 ATF3 通过 P4HA1 促进乳腺癌侵袭：一条潜在的治疗新靶点

为探究乳腺癌对缺氧的适应机制，研究人员研究 HIF1α-ATF3-P4HA1 轴，发现其促进癌细胞侵袭，为治疗提供靶点。

　　在肿瘤的 “小世界” 里，乳腺癌细胞正经历着一场特殊的 “考验”—— 缺氧。肿瘤不断生长，内部的代谢和血管出现异常，导致缺氧区域逐渐形成。缺氧就像一个幕后 “操纵者”，它能改变癌细胞的各种行为，比如让癌细胞更容易从原发部位 “跑” 到身体其他地方，也就是发生侵袭和转移，还能帮助癌细胞抵抗药物的攻击，这些变化都严重影响着癌症患者的治疗效果和预后。然而，在这个复杂的过程中，仍有许多未知等待探索，比如癌细胞是如何在缺氧环境中一步步适应并变得更具侵袭性的，是否存在一些关键的分子和通路在其中发挥着重要作用？这就是本次研究想要解答的问题。

印度科学教育与研究学院博帕尔分校（Indian Institute of Science Education and Research Bhopal）的研究人员针对这些疑问展开了深入研究。他们发现了一条全新的缺氧诱导的 HIF1α-ATF3-P4HA1 轴，这一发现为理解乳腺癌的侵袭机制和开发新的治疗方法提供了重要线索，相关研究成果发表在《Cell Death and Disease》上。

研究人员在研究过程中运用了多种关键技术方法。他们培养了多种细胞系，包括人乳腺癌细胞系 MCF7、HCC1806 以及人胚肾细胞系 HEK293T 等，并对这些细胞进行缺氧处理，模拟肿瘤内部的缺氧环境。同时，通过 RNA 测序（RNA-seq）分析基因表达变化，利用染色质免疫沉淀（ChIP）技术研究蛋白质与 DNA 的相互作用，还采用了定点突变、Western blotting 等方法探究基因和蛋白的功能。此外，他们收集了乳腺癌患者的组织样本，进行免疫组化分析，从临床样本层面验证研究结果。

下面来具体看看研究结果。

1. ATF3 在缺氧应激下通过 HIF1α 在乳腺癌细胞中诱导表达：研究人员首先对之前报道的 RNA-seq 数据集进行分析，发现 ATF3（激活转录因子 3）在缺氧条件下的表达显著增加。通过对乳腺癌患者组织切片的免疫组化分析，也证实了这一结果，并且发现 ATF3 的表达与缺氧标记物 CAIX 的染色呈正相关。进一步研究发现，HIF1α（缺氧诱导因子 1α）在缺氧条件下与 ATF3 启动子区域的缺氧反应元件（HREs）结合增加，通过一系列实验，如构建 ATF3 启动子的荧光素酶报告基因载体、进行 HIF1α-ChIP-qPCR 分析等，证实了 HIF1α 是 ATF3 在缺氧条件下的转录调节因子。
2. ATF3 启动子在缺氧条件下发生表观遗传改变：由于 HIF1α 的结合与 DNA 区域的甲基化状态存在关联，研究人员对 ATF3 启动子区域的甲基化情况进行研究。MeDIP-qPCR 分析显示，ATF3 启动子在缺氧条件下发生去甲基化。通过使用 dCas9-DNMT3A 系统维持 ATF3 启动子 HREs 区域的甲基化，发现 HIF1α 的结合减少，ATF3 的表达也随之降低。进一步研究发现，TET1（Ten Eleven Translocases 1）在缺氧条件下与 ATF3 启动子结合增加，是导致去甲基化的关键酶，且 HIF1α 和 TET1 相互依赖，共同调节 ATF3 启动子的甲基化和转录。此外，研究还发现 PKM2 对 ATF3 的转录也有影响。
3. ATF3 通过诱导胶原组织酶 P4HA1 增强缺氧应激下乳腺癌细胞的侵袭潜力：ATF3 在多种癌症中与 EMT（上皮 - 间质转化）和侵袭相关，研究人员为了探究其在乳腺癌缺氧侵袭中的作用，进行了相关实验。过表达 ATF3 可增加乳腺癌细胞的侵袭能力，敲低 ATF3 则降低侵袭能力。通过 RNA-seq 分析，研究人员发现 P4HA1（脯氨酰 4 - 羟化酶亚基 α1）是 ATF3 的一个重要靶基因，它在胶原蛋白的组织和沉积中起关键作用。进一步研究证实，ATF3 通过结合 P4HA1 启动子，上调其转录，促进乳腺癌细胞的侵袭。
4. P4HA1 在缺氧条件下发生可变剪接：P4HA1 的前体 mRNA 可产生两种异构体，研究人员发现缺氧条件下，P4HA1 的异构体中 9a 外显子的包含增加。通过一系列实验，如 MeDIP-qPCR、CTCF-ChIP-qPCR、RNA Pol II-ChIP-qPCR 等，发现 ATF3 在 P4HA1 的可变剪接中发挥重要作用。ATF3 结合到内含子 9a 位点，招募 TET1 使该区域去甲基化，进而促进 CTCF（CCCTC 结合因子）结合，导致 RNA Pol II 在该区域暂停，最终增加 9a 外显子的包含。
5. P4HA1 9a 异构体赋予乳腺癌细胞在缺氧条件下的侵袭潜力：研究人员通过过表达实验发现，P4HA1 9a 异构体在常氧和缺氧条件下均能增加乳腺癌细胞的侵袭能力，而 P4HA1 9b 异构体则没有这种作用。免疫染色实验表明，P4HA1 9a 异构体能够增加胶原蛋白的沉积，为癌细胞的侵袭提供更有利的细胞外基质（ECM）环境。

研究结论表明，缺氧通过 HIF1α 和 TET1 的协同作用，调节 ATF3 启动子的甲基化，诱导 ATF3 表达。ATF3 不仅上调 P4HA1 的转录，还参与其可变剪接，使 P4HA1 9a 异构体增加，促进胶原蛋白沉积，增强乳腺癌细胞的侵袭能力。HIF1α-ATF3-P4HA1 轴在缺氧乳腺癌细胞的侵袭中起着至关重要的作用，这一发现为乳腺癌的治疗提供了潜在的新靶点。不过，目前关于 ATF3 在乳腺癌细胞适应缺氧过程中的作用还有很多未知之处，例如 ATF3 对其他基因可变剪接的影响等，未来还需要更多的研究来深入探索 。