全流程详解：DS3000与Mutation Surveyor如何分析低频突变

概要

低频突变是指只在一小部分细胞群中发现的突变，通常认为其可能导致癌症的发生。由于其突变的稀有性，在检测低频突变时往往需要特别高的灵敏度和准确度。而对于基于毛细管的Sanger测序仪，难以检测频率低于25%的突变。因此，本次通过使用DS3000紧凑型CE测序仪（以下简称DS3000）与Mutation Surveyor（SoftGenetics公司），展示其可以检测到频率低于5%的低频突变。

结果

Mutation Surveyor内置独有的碱基识别程序，可根据raw data进行波形绘制和碱基序列鉴定。此次，使用Mutation Surveyor与DS3000仪器自带的碱基识别程序分析KRAS的G12A的电泳数据（突变率为20%），发现二者均可以检测出所有G与C的混合碱基（S，图1），并且基于Mutation Surveyor识别≤10%的低频突变的检测率有显著改善（图2）。因此，后续分析均使用Mutation Surveyor进行碱基识别。

图1: 波形数据的比较：使用DS3000（A）或Mutation Surveyor（B）的内置碱基识别程序，分析了相同电泳文件。横轴表示碱基长度（上段）与帧数（下段），纵轴表示信号强度（RFU）。

图2: 比较每个碱基识别程序的检测率。X轴所示频率的突变样品。Y轴表示对于每个样品（循环次数大于等于8次），检测出正确突变的比例。

进一步使用基因突变分析专用标准样品，掺入野生型基因组DNA逐级稀释来模拟不同的突变频率。将Mutation Surveyor识别的突变率与每个基因正确的突变率进行比较，发现EGFR、GNAS、KRAS、NRAS等都可检测出5%左右的低频突变，而在BRAF（V600K）中无法检测出≤20%的突变（图３）。

图3: 所检测的突变率的比较。图中的直线表示正确突变率与检测值完全一致的情况。红框部分表示在GNAS中检测到的假阳性。

实验方法详解

样品准备

本实验中使用了基因分析专用标准样品（Horizon Discovery, Ltd）。该样品是通过编辑将突变引入细胞株基因组DNA，将该样品用野生型DNA稀释后，模拟了各种等位基因频率。（表1）罗列此报告中所用的样品。

表1：分析中所用的样品

实验流程

接着对稀释的基因组DNA进行了PCR（表２-４）。用DNA Clean & Concentrator™ Kit (Zymo Research公司) 纯化PCR扩增子，10 μL EB洗脱后再用QuBit™（Invitro- gen™ 公司）定量。随后，用10 ng 的扩增子进行了循环测序反应（表５、6）。然后将反应产物乙醇沉淀并纯化，用10 μL的HiDi™ formamide（Applied Biosystems™）溶解。通过DS3000进行了测序分析（表7）。最后用Mutation Surveyor（ver. 5.1.2, SoftGenetics公司）对所获取的电泳数据进行了分析。注：本次测序使用野生型DNA的电泳结果作为对照。

表2：PCR引物与退火温度

表3：PCR条件

表4：PCR混合物

表5：循环测序反应条件

表6：循环测序反应系统

表7：电泳条件

分析数据

进行低频突变时，强烈建议对正链与负链都进行测序。并基于野生型基因组对照的电泳数据进行更准确的分析。以下介绍Mutation Surveyor的分析实例。

读取文件之前的设置

首先，进行Mutation Project Settings的设置。从Mutation Surveyor的主界面逐次选择Process→Settings→Mutation Project Settings→Input→Display，并按照图4进行设置。

图4: 读取文件之前的设置。选择“Load Raw Data”时，可以用Mutation Surveyor 独有的碱基识别程序进行分析。

读取文件时的设置

在主界面选择”Open Files”。按照图5，输入GenBank Sequence File、Reference Files、Sample Files。

图5：读取文件时的设置。GenBank Sequence Files: 选择要参考的GenBank文件（.gbk）。Reference Files: 选择野生型对照（突变0%）的测序数据（.ab1）。为了进行准确度高的分析，强烈建议在相同分析中获取Reference Files与Samples Files。Sample Files:选择目标测序数据（.ab1）。

检测处理时的设置

按照图6，进行”Mutation Quantifier”的设置。若有野生型对照，请按照图7，在”Quantification Group Editor”上进行设置。

图6: 读取文件后的设置１。首先，从主界面选择“ Run（”A）。其次，启动”Mutation Quantifier（”，B），并按照（C），输入各个设置值。在“Select Standard 1（0%）”中输入野生型对照，而在“Select Standard 2（100%）”中输入阳性对照(已知突变率的样品数据)。阳性对照的突变率小于100%时，请按照图7，指定突变率。

图7: 阳性对照的设置。阳性对照的突变率小于100%时，用“Quantification Group Editor”的“Standard 2”指定突变率后，执行“ Update”。

结论

在此报告中展示了用Mutation Surveyor分析DS3000电泳数据，可大大提高变异检测率（低至5%的低频突变，图2、3）。

对于实验中可能出现的差异优化，建议从稀释DNA的处理、PCR及循环测序反应（适当调节循环次数、循环时间等）时的扩增偏倚，荧光色素之间的灵敏度之差等因素入手分析，优化调节获得更加准确的测序结果。

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