NGS变局下，基因测序的匠心之选——HiFi测序！

HiFi测序（精准长读长测序）是一种基于CCS的高准确率长读长测序模式，能够在提供长读长（10-25 kb）的同时，兼顾准确性（＞99.9%准确率），从而显著提升基因组组装效率、改善变异检测的灵敏度和准确度，助力全长转录组的分析、甲基化的检测等。

测序技术哪家强？ 

NGS测序，也被称为高通量测序技术，能够一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列读取，不仅大大缩短了测序时间，还显著降低了测序费用。但由于读长的限制，导致二代测序在基因组组装、变异检测、转录组分析等方面有不小的缺陷。

HiFi测序（精准长读长测序）是一种基于CCS（Circular Consensus Sequencing）的高准确率长读长测序模式，能够在提供长读长（10-25 kb）的同时，兼顾准确性（＞99.9%准确率），从而显著提升基因组组装效率、改善变异检测的灵敏度和准确度，助力全长转录组的分析、甲基化的检测等。

NGS测序与HiFi测序比较

HiFi测序应用展示 

参考基因组

HiFi测序是跨生命形式高度准确的基因组组装的首选技术，从细菌到人类，甚至巨型加利福尼亚红杉。HiFi数据的长度和准确性确保了单个序列之间足够的重叠，即使在高同源性区域，也能使用组装软件（如hifiasm）重建基因组，减少错误和不确定区域的数量。利用这些优势，T2T联盟的科学家们使用HiFi测序来填补人类基因组中剩余的8%缺失信息，并在2022年3月呈现了世界上第一个完整的人类基因组组装。

泛基因组构建

HiFi测序技术的出现，使得基因组组装不再消耗大量的人力物力，往往在数天之内即可完成高质量的基因组组装。当这一优势应用于泛基因组的研究与应用时，为泛基因组带来了飞速的发展，可谓是泛基因组时代的引擎。HiFi测序可以最大限度地还原基因组的“原始面貌”，组装出的高质量的单倍型基因组，覆盖SNV、InDel和SV在内的所有变异类型。不仅可以助力完全分型的T2T二倍体参考基因组的组装，也为群体水平基因组研究奠定基础。

复旦大学、西安交通大学和中国科学院的徐书华、杨晓飞、叶凯等多个研究团队共同完成了来自36个少数民族和6个汉族群体的58个核心样本的CPC 116个（单倍型）高质量从头组装的第一次测序工作（第一阶段），提出了CPC参考泛基因组。采用了以HiFi测序为主，ONT、Hi-C和Illumina多种测序技术并行的方法，第一阶段完成的CPC参考泛基因组进行了测序深度>30.65×的HiFi测序，获得了58个核心样本的116个单倍型基因组，平均连续性N50>35.63 Mb，平均基因组大小为3.01 Gb，平均组装质量为52.84。CPC参考泛基因组覆盖了最新参考序列GRCh3的96.54%以及端粒到端粒的单倍体组装的T2T-CHM13的93.59%，这表明CPC参考泛基因组是与HPRC参考泛基因组相当的高质量、染色体水平的单倍型序列。

单倍型分型

在寻找有利的作物特征或人类遗传性疾病的基因基础时，能够完全区分每个染色体的拷贝或单倍型（例如母系或父系遗传）之间的差异是至关重要的，这个过程被称为分型。HiFi测序的长距离能力降低了统计复杂性并增加了正确重建每个染色体拷贝的信心。在大多数情况下，HiFi测序消除了Trio或基于人口的分型技术的需要，这可能对研究团队有限的时间和资源构成重大压力。在一项有关脊髓性肌肉萎缩（SMA）基因组学的研究中，研究人员使用HiFi测序来识别形成非洲人群普遍的两个SMN1单倍型的共同两个拷贝SMN1等位基因。在一个有两个SMN1拷贝的个体中测试这两个单倍型为阳性，其无症状携带者的风险为88.5%，这比目前使用的SNP标记的1.7% -3.0%要高得多，展示了HiFi测序在为SMA开发单倍型分型筛查无症状携带者方面的潜在益处。

变异检测

HiFi测序跨越基因组大区域的能力使其能够在基因组范围内检测变异。极大的插入/删除事件的发生通常难以检测，这是HiFi测序的专业领域之一。同样，HiFi reads可以帮助研究人员检测串联重复和其他高度重复序列的区域，这些区域没有长且准确的reads无法正确分析。全基因组关联研究（GWAS）一直难以解释复杂疾病的遗传性，而HiFi测序的变异检测能力可增强结构变异（50至1,000 bp或更多的基因组变异）的正确鉴定。这提高了研究人员将疾病表型与新基因和致病变异相关联的能力，使他们开始解决某些遗传疾病中缺失遗传性的问题。

全长转录本

基于HiFi测序技术的单细胞异构体测序(Single Cell Isoform-Sequencing，scIso-Seq)技术无需打断RNA，直接对(包含5’UTR直到3’polyA尾序列信息的)全长的cDNA序列进行测序，相比于打断后再组装的NGS技术，能够更加精确地表征整个转录组的细胞类型特异性的全长异构体信息。

瑞士苏黎世联邦理工学院研究团队通过转录本串联技术对三名人类卵巢癌患者进行了单细胞异构体测序，利用该方法捕获了152,000个异构体，其中超过52,000个是新发现的转录异构体。他们同时进行了短读长测序和长读长测序，发现两者单独鉴定的细胞类型和种类占比都非常相似。并且通过 PacBio 的全长 scRNA-seq 数据检测到细胞类型和细胞特异性异构体，揭示了肿瘤和间皮细胞中的差异异构体表达。此外，研究人员还发现了基因融合，包括一种新的经过scDNA测序验证的IGF2BP2::TESPA1融合，该融合在匹配的二代测序短读数据中被错误地归类为高TESPA1表达，并被称为体细胞和种系突变。这是由于二代测序读长较短，无法跨越和覆盖基因的融合位点，从而导致错误的分析结果。

甲基化检测

HiFi测序基于酶动力学的检测，无需对现有的建库和测序流程进行任何修改就能够在一次测序反应中直接获得完整基因组测序&表观基因组。与现有的其它5mC检测技术相比，基于HiFi的5mC检测能够在提供既长又准的测序结果的同时，给出准确的单倍型甲基化信息，因此研究人员可以在单倍型分型和变异调用的基因组上准确定位和研究表观遗传效应。这将有助于科学家在更高的表观遗传学维度了解疾病的起因和解决长期困扰他们的遗传学问题。

多组学分析

通过Fiber-seq（单分子染色质纤维测序）技术，将HiFi测序和MAS-seq串联方法结合起来同步得到基因组、转录组、甲基化和表观基因组分析结果，进行基因组Denovo组装，获得全长转录本以及准确的SNP、InDel、SV并允许同时阐明单倍型分型、CpG甲基化、染色质可及性信息。

在2023年9月发表的预印本中，研究者利用该方法对来自Genome in a bottle (GIAB) 项目的两个细胞系HG001和HG002的遗传变异进行表征，以确定该方法识别遗传变异的准确性。下图为该多组学分析的基因组、表观遗传和转录特征概述。对HG002的检测结果显示，Fiber-seq reads检测SNV，InDel和SV的F1值分别为99.94%，98.81%和92.5%。此外，90.0%的Fiber-seq reads可以准确地进行单倍型定相，生成高质量的基因组组装 (单倍型contig N50 >20 Mb，准确度为QV 50) 。

更多多组学分析文章请见往期链接：

• 基于HiFi测序的多组学分析解析染色质可及性，阐述玉米转座元件的调控潜力

• 精准长读长 HiFi 测序以单分子分辨率揭示嵌合变异对染色质可及性和表观遗传的影响

• HiFi测序揭密DNA复制时核小体如何重新填充染色质纤维

HiFi测序平台选择 

HiFi测序作为全球研究基因组学中最复杂和技术挑战最大的领域的强大测序技术之一，有多种测序平台可供选择。Revio（右）借助高密度SMRT Cell，每次运行最多4个SMRT Cell， 24小时运行时间，具有SPRQ化学成分的Revio系统每天可提供高达480 Gb的HiFi reads，相当于每年2500个人类全基因组，能满足高通量测序需求。Vega（左）创新的将 Revio 平台的技术缩小后集成在桌面式系统中，在更小的仪器占地面积内提供相同质量的 HiFi 数据。Vega使用单张 SMRT Cell，每次运行可生成60 Gb长读长HiFi数据，为客户提供更灵活的测序选择。

左：Vega         右：Revio

两款HiFi测序平台具有相同质量的下机数据，均可支持上述提到的基因组组装、泛基因组构建、变异检测、甲基化分析等应用，您可根据具体实验需求及预算来进行选择。如果您感兴趣，可联系产品经理获取更详细资料，也可联系您身边的基因人~

基因有限公司作为PacBio公司中国区合作伙伴，自2011年以来将PacBio第三代单分子实时测序技术引入国内，一直为国内用户提供专业的三代测序系统的安装培训，技术支持，应用培训与售后维护工作，赢得客户的一致好评与信任。基因有限公司将一如既往的支持越来越多的PacBio用户。

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