什么是Touch-down PCR？

您是否曾在PCR实验中饱受非特异性条带的困扰？是否想用更“聪明”的方法提升实验成功率？今天带您认识常见PCR优化方法——Touch-down PCR。

什么是Touch-down PCR？

1. 高温启动，严格把关

问题：常规PCR中，若退火温度设置不当，引物容易与非目标DNA结合，导致非特异性扩增（如杂带、引物二聚体）。

解决方案：Touch-down PCR在前几个循环中，将退火温度设定为高于引物的理论最佳温度（Tm值）（例如：若引物Tm值为60°C，则初始退火设为65°C）。

效果：只有结合能力最强（即与目标DNA完全匹配）的引物才能“过关”，其他结合力弱的引物被“淘汰”，大幅减少错误产物的生成。

2. 逐步降温，动态优化

过程：每进行1-2个循环，退火温度降低0.5-1°C（如65°C → 64.5°C → 64°C…），直到降至目标温度（如55°C）。

逻辑：初期高温阶段已积累足够多的目标产物（正确扩增的DNA）；随着温度逐渐降低，更多引物（包括部分稍弱匹配的引物）开始结合，但此时目标DNA数量已占绝对优势，反应会优先扩增“正确的”产物。

3. 低温巩固，高效扩增

最终阶段：当温度降至最佳退火温度时，引物与模板的结合效率最高，此时目标DNA被大量复制，进入“指数增长期”，最终获得高产量、高纯度的目标产物。

通过这种“先严后宽”的策略，早期高温度筛选出特异性最强的引物配对，后期低温确保高效扩增，一举两得！

程序图示：

Touch-down PCR常见应用

1. 疑难模板扩增

面对高GC含量、复杂二级结构的模板时，普通PCR易失败，Touch-down PCR通过精准控温可突破扩增瓶颈。

2. 多重PCR优化

多对引物同时反应易出现引物二聚体，梯度降温能有效减少非特异性结合，提高多靶点检出率。

3. 临床诊断与突变检测

在稀有突变检测（如癌症基因筛查）中，高特异性可避免假阳性，结果更可靠。

Touch-down PCR应注意

1. 引物设计

依然遵循常规原则，但可适当增加长度提升退火特异性  

2. 实验注意

⚠️ 温度降落幅度不宜过大，易导致后期扩增效率下降  

⚠️ 当模板浓度过低时建议先进行预扩增  

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工欲善其事，必先利其器。想要完美实现温度梯度控制，一台具备精准温控的PCR仪必不可少！ 

1. 六通道独立控温

TC100采用6个独立的加热模板，每个模块有独立加热和冷却能力，可精准设置 6个不同的温度梯度，相比传统的梯度模式更加准确，减少摸索PCR反应的退火时间。

2. 广泛的实验应用

• 可精准设置6个不同温度梯度，可准确摸索PCR退火温度；

• 温度递增递减功能，可用于Touch-down PCR实验；

• 可在6重不同的温度下进行样品孵育；

• 可同时运行6种不同Tm值引物；

• 可用于Long -PCR实验，扩增高达5kb的片段；

• 可用于巢式PCR实验。

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