新一代测序（NGS）技术平台的别样选择

十多年来，Q30一直是二代测序（NGS）用来衡量测序质量的标准，尽管存在固有的局限性，但这一标准一直被认为“足够好”。PacBio Onso 二代测序仪的出现重新定义了这一标准，其碱基质量分值为Q40+，即碱基错误率为 1/10,000 甚至更低。

Onso系统是一款灵活的台式二代测序仪，通过独特的结合测序 (SBB™) 技术提供出色的准确度（90%的碱基Q40+）。其15倍的准确度提升转换为更高的变异检测灵敏度和更少的测序深度需求。

测序原理

与SBS的一个关键区别是，荧光标记的碱基不被合并到DNA链中，而是在信号捕获后被洗掉。SBB化学分离了测序过程的结合和后续延伸步骤，从而消除了“分子疤痕”引入的错误。

测序模式

Onso的优势

 比传统SBS测序仪高15倍的准确度

Onso独特的SBS技术提供了卓越的准确性和灵敏度，可以自信地识别其他短读长测序平台遗漏的罕见变异。

 更低的测序深度需求

在准确度为Q30时，一些应用如液体活检研究，所需的测序深度较高。Onso系统的Q40+性能，在采用比SBS低4倍的测序深度下，也可提供高质量的结果。

 跨越基因组上的难测区域

Onso近乎完美的测序能准确表征低复杂度、高度重复区域，以助力获得更多更准确的基因组信息。

 无缝兼容现有的短读长生态系统

Onso系统提供更高准确度的文库制备方案，支持各种常见的短读长测序应用。此外，通过简单的文库转换过程，Onso也支持第三方样本和文库制备方案。Onso 输出的FASTQ文件可确保与下游二级和三级短读长测序分析工具的兼容性。

应用举例——液态活检

液态活检是一种对血液和其他液态样本中的循环肿瘤DNA (ctDNA)进行无创检测的方法，有望彻底改变癌症检测和监测的研究。由于ctDNA变异通常发生在非常低的频率，其检测需要高灵敏的技术，而SBB化学的准确度提升，使得Onso在液态活检中具有非常高的低频等位基因检测灵敏度。

1. 灵敏度更高

SBB（Onso系统）在采用与SBS相同的测序覆盖度（6000x）下，对低频等位基因变异的检测灵敏度提升近2倍（图1A）；SBB在采用比SBS低4倍的测序覆盖度（6000x vs 24000x）下，其对低频等位基因变异的检测灵敏度还更高（图1B）。添加基于UMI的重复数据去除还可以进一步提高Onso性能 (图1A中的SBB vs 图1B中的SBB)。 

图1. 通过对10个基因中跨了5个不同等位基因变异频率（0%（WT），0.05%，0.1%，0.25%，0.5%）的已知变异进行检测，来对SBB和SBS测序进行变异检测性能进行测试。(A) 6,000×SBB UMI- vs 6,000× SBS UMI-, (B) 6,000× SBB UMI+ vs 24,000× SBS UMI+。

2. 假阳性更少

由于更高的Q值意味着更高的信噪比，因此Onso系统的Q40+准确度能够以更少的混淆错误实现更自信的变异检测。SBS测序中的测序错误使得几乎不可能从噪声中区分变异(图2A)，而Onso系统上的测序使真正的变异更清晰(图2B)。

图2. SeraCare ctDNA complete mutation mix中NRAS Q61R变异检测的SBS (图A)和SBB (图B) IGV视图。

应用举例——病原检测及抗微生物药物耐药性监测

废水监测可用于监测新的和复发的病原体及其随时间变化的流行情况和新出现的变体。而无需培养的测序方法的进步，尤其是通过 Onso 系统提供的高精度宏基因组测序，为进一步提升这一实践打开了大门。

抗生素抗性基因（ARG）可使细菌逃避某些类别抗生素的作用。全面检查这些基因需要高度准确的测序技术，以正确识别抗性基因及其耐抗生素的类型。

PacBio 和 Zymo Research 合作进行了一项废水监测研究（在2024年的 ASM年会上做过相关介绍）。该研究使用 Zymo公司的 Quick-DNA/RNA Water Kit 处理真实的废水样品，在PacBio Onso系统和Illumina NextSeq 2000系统上分别测序，正面比较了它们在病原检测、抗微生物药物耐药性（AMR）监测和功能分析方面的表现。

两者均采用Zymo分析流程，与NextSeq 2000系统相比，在Onso系统上所有的样本各个分类水平上均获得了更多的分类群（表1）。这意味着，PacBio SBB比SBS检测到更丰富的微生物多样性（图3）。

表1. 使用 PacBio SBB和Illumina SBS 在各个分类水平获得的分类群的数量

图3. 微生物群落分析，属水平的Shannon's Diversity Index。（紫红色代表Onso SBB，橙色代表NextSeq SBS）

在两个测序系统之间，Onso 平台生成了更多针对多种抗生素类别耐药性相关的reads（表2）。

表2. 将Onso 和 NextSeq 测序系统上产生的每个样本的reads分配到 AMR 类别。

当通过相对丰度进行评估时，Onso 系统所揭示的更丰富的多样性得到更明显的体现。Illumina SBS技术只能在每个样本中检测到少数几种 AMR 类别，而PacBio Onso 系统却显示出更广泛的 AMR 类别（图4）。这一点也通过Onso 系统检测到的 ARG 数比 NextSeq 更多得到证实（图5）。由于许多 ARG 都存在于可传播给人类和在人类之间传播的致病细菌中，这些发现有可能直接为公共卫生决策提供参考。

图4. 每个样本的抗生素耐药性类别在 Onso 和 Illumina 测序系统之间的相对丰度呈现。

图5. 采用 Zymo工作流程，分别使用 Illumina SBS和 PacBio SBB测序检测抗生素抗性基因 (ARG)

SBB的超高准确度为研究人员提供了必要的工具，以用于监测和预测疫情、优化公共卫生管理和水处理策略以及为更好的公共卫生政策提出建议。

无论您是关注临床研究、农业基因组、环境监测还是其他领域，Onso系统均能为您提供超高的准确度（≥90%的碱基Q40+）、可扩展性和效率。其应用广泛，涵盖肿瘤基因组学、全外显子测序（WES）、微生物组研究、单细胞测序等。尤其可以为一些需要高灵敏度变异检测的应用如液体活检微小残留病灶（MRD）检测、抗微生物药物耐药性监测、基因编辑实验中脱靶分析等带来突破性的发现。

选择Onso, 拥有Q40+！

基因有限公司作为PacBio公司中国区合作伙伴，自2011年以来将PacBio第三代单分子实时测序技术引入国内，一直为国内用户提供专业的三代测序系统的安装培训，技术支持，应用培训与售后维护工作，赢得客户的一致好评与信任。基因有限公司将一如既往的支持越来越多的PacBio用户。