综述：基因编辑艾美球虫：突破技术瓶颈，助力抗球虫病研究新飞跃

为解决艾美球虫（Eimeria）引发的球虫病防控难题，研究人员开展其遗传操作研究，取得系列成果，意义重大。

　　球虫病，这个在动物界广泛肆虐的 “小恶魔”，主要由艾美球虫属的原生动物寄生虫引发。想象一下，养殖场里，动物们因它遭受腹泻之苦，严重时便血，活力不再，生产力大幅下降。据估算，仅鸡球虫病每年就能让全球畜牧业承受约 100 亿美元的经济损失，其他家禽、家畜因球虫病遭受的损失同样不容小觑。

当前的防控手段都有各自的 “短板”。抗球虫药物虽常用，但长期大量使用使得耐药菌株不断涌现，如今市场上的药物几乎都出现了耐药情况；而且药物残留问题引发食品安全担忧，还会污染环境。活寄生虫疫苗也有局限，目前仅鸡和火鸡的疫苗实现商业化，生产依赖活体动物，产能受限，部分疫苗还可能影响家禽性能，甚至存在致病风险。所以，探寻新的、更有效的球虫病防控策略迫在眉睫。

为此，中国农业科学院动物科学研究所和中国农业大学的研究人员，针对艾美球虫开展了遗传操作相关研究，研究成果发表在《iScience》上。

研究人员在开展研究时，主要运用了以下关键技术方法：一是基因编辑技术，如 CRISPR/Cas9 系统，可对艾美球虫基因进行精准编辑；二是转染技术，将外源基因导入艾美球虫细胞，常用的转染方法包括电穿孔等；三是构建重组艾美球虫技术，用于表达各种抗原，探究其作为疫苗载体的潜力。

下面来看看具体的研究结果：

1. 艾美球虫的遗传操作平台构建
   • 转染相关研究：精心设计转染构建体，像启动子在调控基因表达中起着关键作用，不同艾美球虫物种间启动子功能有一定保守性，也存在差异。筛选出多种适用于艾美球虫转染的受体细胞，其中子孢子应用最为广泛。还采用了多种类型的报告基因，例如荧光蛋白基因、药物抗性基因等，用于监测基因表达和筛选重组寄生虫。电穿孔是常用的转染方法，虽然基础转染效率较低，但通过添加限制性内切酶或使用优化的电穿孔系统（如 Lonza 的 Nucleofector 核转染技术，U - 033 程序），可显著提升转染效率。
   • 基因编辑系统进展：CRISPR/Cas9 系统成功应用于艾美球虫基因编辑，研究人员探索出构建稳定表达 SpCas9 的艾美球虫菌株和 RNP 介导的基因编辑等方法来提高编辑效率。此外，该系统还在分子诊断和表观遗传研究等方面展现出应用潜力。
   • 评估系统建立：建立起从基因组、转录和蛋白质表达水平评估转基因艾美球虫（GM Eimeria）的系统，运用基因组步移、Southern blot、PCR 扩增测序、荧光蛋白检测、蛋白质标签和质谱等多种技术，全面鉴定 GM Eimeria 的特性。
   
   
2. 技术瓶颈与挑战
   • 体外培养系统不完善：缺乏高效的体外培养系统，增加了遗传操作实验的难度和成本，尤其对感染大型动物的艾美球虫研究影响较大。
   • 转染和筛选效率低：艾美球虫转染效率相比其他顶复门寄生虫偏低，且重组寄生虫克隆群体的筛选效率也不高，受宿主免疫反应和接种过程不确定性等因素影响。
   • 筛选基因不足：目前可用的筛选基因存在局限性，一些药物用于动物实验成本高昂，新的抗球虫药耐药突变位点验证耗时费力。
   
   
3. 遗传操作技术的应用
   • 研究寄生虫基因功能：利用表达荧光蛋白报告基因的重组艾美球虫，清晰观察其生命周期和不同发育阶段的形态变化。通过基因编辑技术，深入探究艾美球虫的生物学机制，挖掘和验证药物抗性基因突变，为分析抗球虫药耐药位点提供依据。
   • 重组艾美球虫作为疫苗载体：重组艾美球虫可表达寄生虫、细菌和病毒的保护性抗原，展现出作为疫苗载体的广阔应用前景。比如，表达弓形虫表面抗原 1（TgSAG1）的转基因艾美球虫（EtTgSAG1）能诱导鸡和小鼠产生特异性免疫反应；表达大肠杆菌外源性抗原 CjaA 的转基因艾美球虫可减少鸡肠道中弯曲杆菌的定植；表达传染性法氏囊病病毒（IBDV）VP2 和传染性喉气管炎病毒（ILTV）gI 的重组艾美球虫能引发宿主特异性抗体反应。
   
   

研究结论和讨论部分表明，遗传操作技术为艾美球虫研究带来诸多突破。在疫苗研发方面，构建表达异源保护性抗原的重组艾美球虫，有望开发出具有交叉免疫功能的疫苗，提高疫苗安全性；表达分子佐剂可增强疫苗免疫原性；靶向调控孢子生殖的核心基因，能减少疫苗接种后的副作用。同时，该技术推动艾美球虫向模式生物转变，有助于研究顶复门寄生虫的发育调控和有性生殖机制，还能筛选出早熟品系，为开发减毒活疫苗奠定基础。未来，条件基因敲除系统和人工染色体系统等新技术的开发和应用，将为艾美球虫研究和球虫病防控带来更多可能，持续推动该领域的发展。