钙调神经磷酸酶响应转录因子 Crz1 调控酵母 CMK2 基因表达的关键机制

为探究 CMK2 转录表达调控机制，研究人员发现 Crz1 通过 CMK2 启动子单一 CDRE 位点调控其表达，意义重大。

　　

探秘酵母基因调控：Crz1 与 CMK2 的奇妙 “对话”

在微观的细胞世界里，基因表达的调控就像一场精密的交响乐演奏，每一个音符都至关重要。哺乳动物的钙 / 钙调蛋白依赖性蛋白激酶 II（CaMKII）作为学习和记忆的核心调节者，在神经细胞中调控着钙信号传导，对生命活动有着深远影响。而在真核生物这个大家族里，钙信号通路高度保守，小小的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）便成为了科学家们研究钙信号的绝佳模型。

酿酒酵母中有两个与哺乳动物 CaMKII 同源的蛋白，Cmk1 和 Cmk2。其中，Cmk2 可不是个 “小透明”，它身兼数职，不仅和 Rch1 携手负向调节酵母细胞的钙摄取，还在钙信号传导以及内质网、液泡膜上钙泵编码基因 PMR1 和 PMC1 的表达调控中发挥着关键作用。不仅如此，Cmk2 还参与调节酵母细胞内脂肪酸合成酶 β 亚基 Fasl 的功能，抑制内质网应激诱导的非凋亡性细胞死亡。在另一种酵母裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）中，Cmk2 也没闲着，它通过与哺乳动物 RACK1 的同源物 Cpc2 激酶相互作用，负向调节翻译过程。

此前的研究表明，在钙应激条件下，CMK2 的转录表达依赖于钙调神经磷酸酶响应锌指 1 转录因子（Crz1） ，蓝光照射也能触发 Crz1 依赖的 CMK2 转录。然而，Crz1 究竟是如何调控 CMK2 转录表达的，这中间还有许多谜团等待解开。为了搞清楚这些问题，广西科学院的研究人员踏上了探索之旅，他们的研究成果发表在了《Scientific Reports》上。

研究人员为了深入探究这一调控机制，使用了多种关键技术方法。在构建各种质粒方面，他们精心操作，构建出用于研究的质粒，如 CMK2p - lacZ 报告基因质粒等。蛋白质纯化技术也派上了用场，通过诱导表达和纯化 His6 - Crz1（N339 - S678）蛋白，为后续实验做准备。而电泳迁移率变动分析（EMSA）和染色质免疫沉淀（ChIP）实验则是重中之重，前者用于研究蛋白与 DNA 的体外结合情况，后者则能探究体内蛋白与 DNA 的结合情况，这些技术为研究提供了关键数据支持。

研究人员构建了 CMK2p - lacZ 报告基因 pRS316 - CMK2p - lacZ 。实验发现，在野生型细胞中，用 0.2M CaCl₂处理 2 小时后，CMK2p - lacZ 的活性增加了近 30 倍；但当 CRZ1 基因缺失时，这种钙诱导作用大幅降低。不过，在缺乏 CRZ1 的 BY4743 细胞中，CMK2p - lacZ 的活性仍能被钙应激诱导约 2 倍。这表明除了 Crz1，可能还有其他因素参与调控 CMK2 的表达。

基于之前研究中钙调神经磷酸酶 / Crz1 依赖基因上游区域的共有基序（5’ ?G?A?G?G?C?T?G 3’），研究人员在 CMK2 启动子中找到了 4 个潜在的 Crz1 结合位点。对这 4 个位点进行突变分析后发现，M1、M2 和 M3 位点的突变对 CMK2p - lacZ 的活性没有影响，然而 M4 位点突变后，野生型细胞中 CMK2p - lacZ 的活性在有无 0.2M CaCl₂的情况下都显著降低。即便如此，突变后的 CMK2p - lacZ - M4 活性仍能被钙应激诱导约 3 倍。这一系列结果说明，Crz1 很可能与 CMK2 启动子中的（G₁₇₇AGGCT）基序结合，并且在钙应激时，CMK2 的转录表达主要由 Crz1 调控，但也有其他因素参与其中。

为了验证 Crz1 是否能在体外与（G₁₇₇AGGCT）基序结合，研究人员起初尝试表达 His6 标记的全长 Crz1，但未能成功诱导表达。于是他们构建了 pET28a - ScCrz1（N339 - S678），表达含有 DNA 结合结构域的 His6 标记的 Crz1 C 末端区域（N339 - S678）。成功诱导并纯化该蛋白后，通过 EMSA 实验发现，His6 - Crz1（N339 - S678）能够与包含该基序的 DNA 探针结合，且这种结合能被未标记的探针竞争性抑制。这就表明，Crz1 在体外可以与 CMK2 启动子中的这个 CDRE 基序结合。

为进一步确认 Crz1 在体内是否能与该 CDRE 基序结合，研究人员进行了 ChIP 实验。实验结果显示，在添加 0.2M CaCl₂培养的 Crz1 - GFP 菌株的抗 GFP 免疫沉淀（IP）样本中，CMK2 启动子的 CDRE 区域高度富集；而在未添加 CaCl₂培养的样本中，几乎检测不到该区域。这充分证明，在体内环境下，Crz1 能够与酵母细胞中 CMK2 启动子的这个 CDRE 区域结合。

这项研究意义非凡。此前已知共有 41 个转录因子（TFs）参与正常、急性热休克、突然葡萄糖过量和氨基酸饥饿等条件下 CMK2 表达的调控，但在钙应激条件下，只有 Crz1 被报道参与调控 CMK2 的表达。此次研究明确了 Crz1 主要负责但并非唯一调控 CMK2 在钙应激下的转录表达，还有其他未知因素参与其中。并且确定了 Crz1 是通过 CMK2 启动子上的单一 CDRE 位点（G₁₇₇AGGCT）来调控其转录表达的。此外，研究还发现，在缺乏 CRZ1 或 CMK2 启动子中 Crz1 结合位点突变的酵母细胞中，CMK2 的转录表达仍能被钙诱导，这意味着除 Crz1 外的其他调控因素可能对酵母细胞的钙耐受性有重要贡献。这些发现为深入理解酵母细胞的钙信号调控网络以及基因表达调控机制提供了关键线索，也为后续相关领域的研究奠定了坚实基础。