《Nature Microbiology》利用合成还原甘氨酸途径固定一碳，产量超越卡尔文循环

为提高微生物利用可再生甲酸的产量，德国马克斯?普朗克分子植物生理学研究所等机构研究人员用还原甘氨酸途径（rGlyP）替代卡尔文 - 本森 - 巴斯姆循环（CBB），工程菌株生物质产量提高 17%，为可持续生物生产提供可能。

　　

### 微生物 “新食谱”：合成代谢开启可持续生物生产新篇章
在可持续发展的大背景下，寻找可再生资源用于微生物生产，成为科研人员关注的焦点。甲酸，作为一种潜在的可再生底物，有望为微生物提供 “绿色能源”，助力食品、燃料和化学品的可持续生产。然而，传统的卡尔文 - 本森 - 巴斯姆循环（CBB）在利用甲酸时，存在能量效率低的问题，就像一辆耗油量大但跑得慢的汽车，限制了微生物的生长和产量。那么，有没有更高效的 “代谢引擎”，能让微生物更好地利用甲酸呢？

为了解决这个问题，来自德国马克斯?普朗克分子植物生理学研究所、马克斯?普朗克陆地微生物研究所等多个机构的研究人员展开了探索。他们将目光聚焦在一种更具潜力的合成途径 —— 还原甘氨酸途径（rGlyP）上，试图用它来替换微生物原本效率不高的 CBB 循环，看看能否为微生物的生长和生产带来新的突破。这项研究成果发表在《Nature Microbiology》杂志上，为可持续生物生产领域带来了新的曙光。

研究人员在实验过程中运用了多种关键技术方法。首先是基因工程技术，通过质粒消除、转座子介导的基因整合等手段，对 Cupriavidus necator（一种微生物）的基因组进行精确改造，让 rGlyP 成功整合到其基因组中。其次，利用定量蛋白质组学技术，深入分析不同菌株的蛋白质表达情况，了解代谢途径的变化。此外，借助生物反应器实验和代谢建模，准确测定菌株的生物质产量，并从理论上预测不同途径的效果。

构建基因组整合 rGlyP 的菌株

研究人员以之前构建的 CRG4 菌株为基础，先去除表达 rGlyP 第一个模块（C1 模块）的质粒，再利用 Tn5 - 转座子机制，将表达 C1 模块的操纵子文库整合到基因组中，筛选出快速生长的 CRG5 菌株。随后，用同样的方法将 C3 模块也整合到 CRG5 基因组中，得到 CRG6 菌株，其 rGlyP 完全整合到基因组中。通过对这些菌株的生长特性和基因组序列进行表征，发现 CRG6 虽然在分批培养中的倍增时间比野生型 CBB 循环菌株慢，但能达到更高的最大生物量光密度。

分析 rGlyP 菌株的细胞蛋白质组分配

为了探究 rGlyP 菌株 CRG4（质粒表达）和 CRG6（基因组表达）以及 CBB 循环菌株的细胞蛋白质组分配差异，研究人员进行了定量蛋白质组学分析。结果显示，基因组整合后 C1 模块的蛋白质组分配仅略有下降，而 C3 模块的分配减少了十倍以上，这表明在 CRG4 中 C3 模块存在冗余高表达。整体上，CRG6 中与 rGlyP 相关的蛋白质组分配约 13% 被释放出来，可能用于核糖体生物合成等其他过程，从而提高了 CRG6 菌株的生长速率。

探究 rGlyP 的生物质产量

研究人员通过体内甲酸脱氢酶抑制试验和甘氨酸氧化酶缺失（ΔdadA6）实验，在 rGlyP 的两个关键分叉点（甲酸和甘氨酸）探究是否存在浪费性氧化途径限制生物质形成，但未观察到生长速率或产量的进一步改善，这表明细胞可能已经平衡了甲酸同化通量和能量生成。

为准确测定 rGlyP 和 CBB 循环菌株利用甲酸的生物质产量，研究人员使用生物反应器在恒化器模式下，以相同的稀释率（0.05 h^-1 ，即倍增时间约 14 h）进行培养。实验结果显示，CBB 循环菌株的生物质产量为 3.88 ± 0.19 g CDW mol^-1 ，rGlyP 菌株为 4.52 ± 0.17 g CDW mol^-1 ，rGlyP 菌株比野生型在相同条件下产量提高了 16.6%。这一结果与基因组规模代谢模型（GEM）的理论预测相符，证实了能量效率更高的 rGlyP 确实能够支持预期的产量增加。

在恒化器实验结束时，研究人员将稀释率提高到 0.087 h^-1 （对应倍增时间 8 h），rGlyP 菌株在此条件下达到了目前测量到的最快生长速度。但当稀释率提高到 0.1 h^-1 时，CRG6 ΔdadA6 菌株被洗出，说明它还无法维持与使用 CBB 循环的野生型菌株一样快的生长速度（野生型最快倍增时间约 4 h）。

研究结论与讨论

这项研究表明，工程化的一碳（C1）同化途径在生物质产量上可以超越自然途径。实验测量的 rGlyP 菌株利用甲酸的生物质产量（4.52 g CDW mol^-1 ），高于目前报道的所有利用 CBB 循环的天然生物以及工程化甲酸营养型生物的产量。同时，测量产量与理论预测产量相近，说明工程菌株的代谢网络，包括合成同化途径，运行良好，没有明显的能量浪费代谢过程。

与大肠杆菌和酿酒酵母等经过工程改造的甲酸营养型和甲基营养型生物相比，C. necator 在利用 rGlyP 进行生长时，能够更有效地抑制三羧酸（TCA）循环的活性，避免乙酰辅酶 A 的浪费，从而提高甲酸的利用效率和产量。这可能是因为 C. necator 在长期进化过程中，已经适应了自养代谢，其代谢网络更适合这种高效的合成途径。

该研究为未来的生物生产提供了新的思路和方向。一方面，其他具有潜力的能量高效合成 C1 固定途径，如合成巴豆酰辅酶 A - 乙基丙二酰辅酶 A - 羟基丁酰辅酶 A（CETCH）循环，有望在成功建立后超越 CBB 循环，实现更高的产量。另一方面，将这些高效的 CO₂固定途径引入自养宿主，如 C. necator 或光合微生物，利用它们本身已经良好连接的自养代谢网络，可能会进一步提高生物生产的效率。此外，研究中使用的（随机化）转座子整合技术和生长耦合选择方法，也可以为在更难工程化的细菌以及真核生物（如酵母和微藻）中实现高效途径提供参考。

总的来说，这项研究为可持续生物生产奠定了坚实的基础，有望推动基于碳的化学品、燃料、饲料和食品的高效、可持续生产，让我们在迈向绿色未来的道路上又前进了一步。