《Experimental Hematology & Oncology 》shRNA 介导 TET2 基因沉默：增强 CD19 CAR-T 细胞抗肿瘤活性的新策略

为解决 CAR-T 细胞疗法长期缓解率低的问题，研究人员通过 shRNA 介导 TET2 基因沉默，增强了 CD19 CAR-T 细胞抗肿瘤活性，为免疫治疗提供新选择。

　　

一、研究背景

嵌合抗原受体 T 细胞（CAR-T）疗法在血液癌症治疗领域掀起了一阵 “风暴”，给众多患者带来了新的希望。这种疗法就像是给 T 细胞装上了精确制导的 “导航仪”，让它们能够精准地识别并攻击癌细胞。然而，随着时间的推移，人们发现 CAR-T 疗法并非完美无缺。长期随访研究显示，接受 CD19 CAR-T 细胞治疗的患者，3 年后仅有 50% 能维持完全缓解状态。这就好比一场战斗，虽然初期取得了一定胜利，但后续却难以持续巩固成果，肿瘤复发的阴影依然笼罩着患者。

为了突破这一困境，全球的科研人员都在积极探索。此时，一个意外的发现引起了大家的关注。Fraietta 等人发现，在一位慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者中，CAR 基因插入无意间破坏了 Ten-Eleven Translocation-2（TET2）基因，结果 CD19 CAR-T 细胞的疗效却显著增强了。TET2 基因编码的甲基胞嘧啶双加氧酶（methylcytosine dioxygenase）在 DNA 去甲基化过程中起着关键作用，但它与 CAR-T 细胞疗效之间的联系此前却并不十分清楚。基于此，研究人员希望通过深入研究，探索能否人为地调控 TET2 基因，来提升 CAR-T 细胞的抗肿瘤活性，从而为血液癌症患者带来更好的治疗效果。

二、研究概况

本次研究由相关研究人员开展，致力于探索增强 CD19 CAR-T 细胞抗肿瘤活性的新策略。研究发现，通过 shRNA 介导 TET2 基因沉默，能够显著提升 CD19 CAR-T 细胞在临床前模型中的抗肿瘤活性，为免疫治疗提供了一种新的可选方案。该研究成果为血液癌症治疗领域带来了新的思路和希望，相关论文发表在未提及具体期刊的文献中 。

研究人员采用了多种关键技术方法来开展研究。在基因载体构建方面，设计并构建了共表达 CD19 CAR 和 TET2 shRNA 的一体化载体。细胞实验技术上，将不同的 shRNA 通过慢病毒载体转导至 293T 细胞，筛选出最有效的 TET2-shRNA-1 序列；同时对 CD19 CAR-T 细胞和 TET2-1-CD19 CAR-T 细胞进行体外细胞毒性、细胞因子分泌等功能检测。动物实验技术上，利用 NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ（NSG）小鼠建立异种移植小鼠模型，评估 TET2-1-CD19 CAR-T 细胞的体内抗肿瘤活性。

三、研究结果

1. 筛选有效沉默 TET2 基因的 shRNA 序列：研究人员设计了多种针对 TET2 基因的 shRNA，其中 TET2-shRNA-1 序列来自已发表文献，TET2-shRNA-2 至 7 则通过 BLOCK-iT? RNAi Designer 工具获得。将这些 shRNA 分别通过慢病毒载体转导至 293T 细胞后发现，TET2-shRNA-1、4、6 和 7 都能降低 TET2 基因的表达，而 TET2-shRNA-1 的沉默效果最为显著。

2. TET2 基因沉默对 CD19 CAR-T 细胞体外功能的影响：研究人员评估了 TET2-1-CD19 CAR-T 细胞对 CD19 阳性表达萤火虫荧光素酶的 Nalm6 细胞（Nalm6-Luc）的细胞毒性。结果显示，与传统 CD19 CAR-T 细胞相比，TET2-1-CD19 CAR-T 细胞对 Nalm6-Luc 细胞的细胞毒性并未减弱。在对另一种 CD19 阳性表达萤火虫荧光素酶的 Daudi 细胞（Daudi-Luc）的裂解实验中，也得到了类似结果。在细胞因子分泌功能检测方面，当识别 CD19 抗原后，TET2-1-CD19 CAR-T 细胞分泌的 IFN-γ、TNF-α、GM-CSF、IL-2 和颗粒酶 B（Granzyme B）等细胞因子浓度与 CD19 CAR-T 细胞相当。此外，TET2 基因沉默也未明显改变 CAR-T 细胞表面的表型（如 CD4 和 CD8）和耗竭（如 PD-1、Tim-3 和 LAG-3）标记物的表达水平。这表明 TET2 基因沉默在体外不会对 CD19 CAR-T 细胞依赖 CAR 的细胞毒性功能或细胞因子分泌产生不利影响。

3. TET2-1-CD19 CAR-T 细胞在异种移植小鼠模型中的抗肿瘤活性：研究人员利用 NSG 小鼠建立异种移植小鼠模型，将注射了 Nalm6-Luc 细胞的小鼠分为四组，分别静脉注射 PBS、未转导的 T 细胞（NTD）、CD19 CAR-T 细胞和 TET2-1-CD19 CAR-T 细胞。结果显示，与其他组相比，接受 TET2-1-CD19 CAR-T 细胞治疗的小鼠生存率显著提高，体内肿瘤的生物发光明显降低，这表明 TET2-1-CD19 CAR-T 细胞能有效减轻肿瘤负担，显著提高小鼠生存率。

四、研究结论与意义

本研究通过 shRNA 介导 TET2 基因沉默，成功增强了 CD19 CAR-T 细胞在临床前模型中的抗肿瘤活性。这一研究成果为改善 CAR-T 细胞疗法提供了新的策略，有望提高血液癌症患者的治疗效果。虽然 shRNA 介导的 TET2 基因沉默作为一种表观遗传编程方法，可能存在与 CRISPR-Cas9 介导的 TET2 基因敲除类似的潜在风险，如 CAR-T 细胞的无节制增殖，但由于 shRNA 介导的是 mRNA 下调而非基因敲除，因此可作为 CRISPR-Cas9 介导的 TET2 基因敲除的替代表观遗传编程方法，为免疫治疗领域提供了新的研究方向和潜在治疗手段。