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为解决结外 NK/T 细胞淋巴瘤（ENKTL）免疫治疗耐药及缺乏有效预测标志物问题，三星医疗中心研究人员开展 miRNA 调控 PD-L1 研究，发现 miR-340-5p 或可预测帕博利珠单抗疗效，为精准治疗提供依据。
结外 NK/T 细胞淋巴瘤（Extranodal NK/T-cell lymphoma，ENKTL）是一种罕见且侵袭性很强的非霍奇金淋巴瘤，它如同隐藏在人体免疫系统中的 “破坏者”，严重威胁着患者的生命健康。这种淋巴瘤起源于自然杀伤（NK）细胞或细胞毒性 T 细胞，并且与爱泼斯坦 - 巴尔病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染密切相关。EBV 的存在会促使淋巴瘤细胞上调程序性死亡配体 1（Programmed death ligand 1，PD-L1）的表达，PD-L1 就像肿瘤细胞的 “保护伞”，它与效应 T 细胞上的程序性细胞死亡蛋白 1（Programmed cell death protein 1，PD-1）结合后，会导致 T 细胞 “精疲力竭”，使免疫系统难以发挥对肿瘤的杀伤作用。
目前，免疫检查点抑制剂为 ENKTL 患者带来了新的希望，像帕博利珠单抗（pembrolizumab）这类针对 PD-1 的药物，在治疗 ENKTL 方面展现出了一定的潜力，成为复发或难治性 ENKTL 患者的重要治疗选择。然而，现实却不尽如人意，并非所有患者都能从这种治疗中获益，部分患者在治疗过程中病情依旧会进展或复发，这意味着免疫检查点抑制剂存在耐药问题。而且，由于缺乏有效的生物标志物来预测治疗失败的风险，医生在选择治疗方案时往往面临诸多困惑，难以做到精准治疗。
为了突破这些困境，三星医疗中心的研究人员开展了一项极具意义的研究。他们致力于探索微小 RNA（MicroRNAs，miRNAs）在调控 PD-L1 表达中的作用，期望能找到可预测 ENKTL 患者对免疫检查点抑制剂治疗反应的生物标志物，为精准治疗提供有力支持。这项研究成果发表在了《Scientific Reports》期刊上。
在研究过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。他们从三星医疗中心选取了接受帕博利珠单抗治疗的复发或难治性 ENKTL 患者，建立了样本队列。通过 RNA 测序来筛选差异表达的 miRNA；利用核糖核蛋白免疫沉淀（RNP-IP）技术，确定 miRNA 与 PD-L1 mRNA 的相互作用；借助荧光素酶报告基因测定，验证 miRNA 对 PD-L1 表达的调控作用；还运用免疫组织化学和酶联免疫吸附测定（ELISA）等技术，检测组织和血清中的相关指标。
下面来详细看看研究结果：
- PD-L1 在依托泊苷耐药 ENKTL 细胞中的调控机制：研究人员此前构建了依托泊苷耐药的 ENKTL 细胞系（SNK6R），发现它不仅对依托泊苷具有显著抗性，而且 PD-L1 表达也大幅增加。通过 Ago2 RNP-IP 实验，他们发现耐药细胞中 PD-L1 mRNA 在 Ago2 免疫沉淀（IP）中的富集程度低于亲本细胞，这暗示 miRNA 可能参与了耐药细胞中 PD-L1 的上调过程。进一步的 miRNA 测序分析显示，与亲本 SNK6 细胞相比，耐药细胞中有 18 种 miRNA 下调，10 种 miRNA 上调。其中，miR-30d-3p、miR-148a-3p、miR-221-5p、miR-340-5p、miR-378a-3p 和 miR-424-5p 这 6 种 miRNA 在耐药细胞中显著下调，且被预测可靶向 PD-L1 mRNA。经过 RT-qPCR 和蛋白质免疫印迹（Western blotting）验证，除 miR-221-5p 外，其他几种 miRNA 在 SNK6R 细胞中的表达确实低于对照组。进一步研究表明，miR-340-5p 和 miR-424-5p 可下调 PD-L1 表达，在耐药细胞中对 PD-L1 的调控起到关键作用。
- miR-340-5p 和 miR-424-5p 对 ENKTL 细胞中 PD-L1 的调控探索：为了深入了解 miR-340-5p 和 miR-424-5p 对 PD-L1 表达的调控机制，研究人员在 ENKTL 细胞中转染了这两种 miRNA 的抑制剂和模拟物。结果发现，转染 miR-340-5p 或 miR-424-5p 的抑制剂会使 SNK6 细胞中 PD-L1 蛋白水平升高；而转染模拟物则会降低 SNK6R 细胞中 PD-L1 蛋白和 mRNA 水平。Ago2 RNP-IP 实验表明，增加 miR-340-5p 或 miR-424-5p 的水平会增强 PD-L1 mRNA 在 Ago2 IP 中的富集。荧光素酶报告基因测定显示，这两种 miRNA 与野生型 PD-L1 mRNA 的 3’非翻译区（3’UTR）结合时，可抑制荧光素酶活性，但当种子区域发生突变时，这种抑制作用消失。这一系列实验证实，miR340-5p 和 miR-424-5p 通过直接结合 PD-L1 mRNA 的 3’UTR 来调控其表达，进而影响 ENKTL 细胞中这一关键免疫检查点的功能。
- ENKTL 患者中 miRNA 与 PD-L1 的相关性：研究人员对 3 例患者的活检标本进行免疫组织化学和 RT-qPCR 检测，这 3 例患者的 PD-L1 综合阳性评分（Combined Positive Score，CPS）各不相同。结果发现，PD-L1 表达低或无表达的患者，其肿瘤组织中的 miR-340-5p 水平显著高于 PD-L1 高表达的患者；血清中 miR-340-5p 水平在 PD-L1 高表达患者中也较低。对 16 例患者血清样本的进一步分析显示，miR-340-5p 水平与 PD-L1 CPS 呈负相关。而 miR-424-5p 在肿瘤组织和血清中的表达与 PD-L1 表达水平均无显著相关性。
- miR-340-5p 与可溶性 PD-L1 及帕博利珠单抗治疗反应的关联：在 38 例患者中，研究人员发现血清 miR-340-5p 水平与可溶性 PD-L1 呈显著负相关。对 19 例接受帕博利珠单抗治疗且治疗前有血清样本的患者分析发现，疾病进展（PD）组的 miR-340-5p 水平显著低于完全缓解（CR）/ 部分缓解（PR）组。在 16 例接受挽救治疗的患者中，所有达到完全缓解的患者血清 miR-340-5p 水平均低于 - 10，而大多数未缓解患者的该水平高于 - 10。这表明血清 miR-340-5p 水平与帕博利珠单抗的治疗反应存在潜在关联，有望作为预测治疗反应和评估预后的生物标志物。
综合研究结论和讨论部分，这项研究意义重大。研究人员首次发现 miR-340-5p 在 ENKTL 肿瘤细胞中，尤其是在依托泊苷耐药的 ENKTL 细胞中，对 PD-L1 表达起着重要的调控作用。血清 miR-340-5p 水平与 PD-L1 表达、可溶性 PD-L1 水平以及帕博利珠单抗的治疗反应均密切相关，这意味着在治疗前检测血清 miR-340-5p 水平，或许能够帮助医生更好地选择适合的治疗方案，提高免疫检查点抑制剂的治疗效果，为 ENKTL 患者带来新的希望。不过，该研究也存在一定局限性，比如仅使用了一种细胞系，患者样本量较小等。未来还需要更多大规模的研究来进一步验证这些发现，明确 miR-340-5p 作为生物标志物的可靠性和临床应用价值，推动 ENKTL 免疫治疗的精准化发展。
